异氟醚麻醉对脑内erk1-2和pkcγ磷酸化水平的影响

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1、异氟醚麻醉对脑内ERK1/2和PKCγ磷酸化水平的影响【摘要】目的:探讨异氟醚麻醉对脑内ERK1/2和PKCγ磷酸化水平的影响。方法:采用雄性BALB/c小鼠,随机分为5组,即对照组(Con):未麻醉;异氟醚麻醉5min组(Iso1);异氟醚麻醉1h组(Iso2);麻醉1h后停药2min组(E1):异氟醚麻醉1h后,小鼠脱离麻醉环境2min;麻醉1h后停药1h组(E2):异氟醚麻醉1h后,小鼠脱离麻醉环境1h。用异氟醚进行麻醉后进行APK信号传导系统是一重要的细胞信号传递方式,影响着细胞的增殖、分化等多种生物学过程,并与其他的信号传递系统间存在着复杂的联系。因此,我们通过脑内E

2、RK1/2和PKCγ磷酸化水平对异氟醚麻醉的分子机制进行了研究。　　1材料和方法　　1.1材料雄性BALB/c小鼠60只,8周龄,体质量18～22g,由河南康达实验动物有限公司提供。动物购回后在新环境中先适应1周,以减少或去除新奇环境应激对实验结果的可能影响。1周后将动物随机分为5组(每组n=12):(1)对照组(Con):未麻醉;(2)异氟醚麻醉5min组(Iso1);(3)异氟醚麻醉1h组(Iso2);(4)麻醉1h后停药2min组(E1):异氟醚麻醉1h后,小鼠脱离麻醉环境2min;(5)麻醉1h后停药1h组(E2):异氟醚麻醉1h后,小鼠脱离麻醉环境1h。　　1.2方法

3、(1)动物麻醉:将各处理组小鼠置于透明的不完全封闭的麻醉箱中进行麻醉,对照组吸入1000mL/L纯氧5min后直接脱臼处死;用麻醉机向麻醉箱中通入异氟醚,待小鼠翻正反射消失后,维持异氟醚于1MAC(minimumalveolarconcentration)5min(Iso1组)或1h(Iso2、E1和E2组)。(2)in,使组织完全被裂解后,吸出组织匀浆,用低温离心机4℃12000r/min离心10min。吸取上清,用BCA试剂法测定蛋白浓度。加入loadingbuffer后,100℃煮沸10min,分装后存于-20℃冰箱待用。样本从冰箱中取出后,离心5min,按照蛋白定量得到

4、的浓度加不同体积的样品,使得每个加样孔的上样量基本为50μg,进行100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质由SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至NC膜,用10g/LBSA室温封闭膜1h。pERK1/2多克隆抗体(或pPKCγ)和βActin用抗体稀释液稀释,将膜分别置于这两种一抗中室温孵育2h。TBST清洗,5min×3次,二抗室温孵育1h。二抗为生物素化的羊抗兔IgG,用抗体稀释液稀释。TBS清洗,5min×3次。生物素卵白素辣根过氧化物酶复合物室温孵育1h。TBS清洗,5min×3次。硫酸镍胺加强DAB蓝色反应法呈色。待有清晰蓝色目的条带出现时,终止反应。将条带用计算机成像系统采

5、像,用ImageProPlus6.0分析软件测量各组条带的光密度值(A值)。　　1.3评价指标以动物翻正反射消失和翻正反射恢复作为判断麻醉产生和动物清醒的指标;以βActin为内参,pERKA/ActinA为ERK表达水平指标,pPKCγA/ActinA为pPKCγ表达水平指标。　　1.4统计学分析实验数据采用软件SPSS12.0软件进行统计学处理和分析,计量资料以x±s表示,各组间整体差别采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1各组小鼠脑内皮质pERK1/2表达情况比较在Con组,pERK1/2呈现高表达状态,给予异氟醚麻醉处理组(Iso1

6、和Iso2组),pERK1/2表达减弱(P<0.05),当异氟醚麻醉停止后(E1和E2组),pERK1/2表达逐渐恢复,与Con组相比无统计学差异,与异氟醚处理组相比,有统计学差异(P<0.05,图1)。　　2.2各组小鼠脑内皮质pPKCγ表达情况的比较在Con组,pPKCγ呈现高表达状态,给予异氟醚麻醉处理组(Iso1和Iso2组),pPKCγ表达减弱(P<0.05),当异氟醚麻醉停止后(E1和E2组),pPKCγ表达逐渐恢复,与Con组相比无统计学意义,与异氟醚处理组相比,有统计学差异(P<0.05,图2)。　　3讨论　　ERK(extrace

7、lluarsignalregulatedkinase)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,是传递丝裂原信号的信号转导蛋白。ERK涉及到调节细胞的多种生理功能,在多种疾病的发病机制和病理生理过程中以及行为反应和认知方面如学习、记忆等都起着关键的作用[2]。脑组织内ERK1/2蛋白激酶磷酸化参与调节突触可塑性、长时程增强进而影响记忆的形成[3,4]。Selcher等[5]报道在小鼠海马内注射PD98095,或者通过全身给药的方式给予可以通过血脑屏障的强效E