人参皂苷rg1激活pi3k-akt信号通路对6

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1、人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6【摘要】目的探讨人参皂苷Rg1对抗6羟基多巴胺(6OHDA)毒性作用的信号通路。方法MES23.5细胞常规培养，免疫印迹法观察人参皂苷Rg1预处理对6OHDA诱导的磷酸化蛋白激酶B(Akt)表达的影响，MTT法观察细胞的存活率。结果6OHDA可时间依赖性地降低MES23.5细胞磷酸化Akt的表达(F=24.51,P<0.01)，人参皂苷Rg1预处理可明显增强磷酸化Akt的表达(t=471.60,P<0.01);人参皂苷Rg1预处理可明显降低6OH

2、DA对MES23.5细胞的损伤作用，此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002所阻断(F=25.12,P<0.01)。结论人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt信号通路对抗6OHDA对MES23.5神经细胞的毒性作用。【关键词】人参皂甙;羟多巴胺;毒性作用;蛋白激酶B;神经元[ABSTRACT]ObjectiveTostudythesignalingpathethod,andthecellsurvivalobservedbyMTTmethod.Results6OHDAinhibi

3、tedtheAktphosphorylationinatimedependentmannerinMES23.5cells(F=24.51,P<0.01).Pretreatmententine;Toxicactions;CaseinkinaseB;Neurons　　帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元功能障碍[1,2]。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制密切相

4、关。目前对PD的治疗手段不断发展，可分为药物治疗、基因治疗和外科治疗等，但药物治疗长期应用后的副作用、外科手术治疗的昂贵及远期疗效的不确定性，使得各国学者试图从不同的角度入手，探寻新的治疗方法。人参皂苷是人参的主要活性成分，包含有30多种人参单体，如Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc等，Rg1在人参皂苷中的含量丰富。近年来的研究显示，人参皂苷Rg1具有多种生物活性[3,4]，特别是在中枢神经系统，Rg1具有神经营养和神经保护作用。本研究室的前期实验已揭示Rg1可以对抗6OHDA对MES23.5神经元的损伤[5]

5、，为了进一步探讨人参皂苷Rg1对抗6OHDA毒性作用的机制，本研究应用6OHDA损伤MES23.5神经细胞，建立PD细胞模型，并应用人参皂苷Rg1进行干预，从细胞和分子水平探讨6OHDA诱导神经毒性的信号途径以及Rg1的保护效应，以期为人参皂苷Rg1的神经保护作用机制提供进一步的实验依据。　　1材料与方法　　1.1试剂及其　　纯度为99.9%人参皂苷Rg1购自白求恩医科大学;DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);6OHDA购自Sigma公司(美国);抗Akt抗体购自SantaCruz公

6、司(美国);抗磷酸化Akt抗体购自购自Cellsignaling公司(美国);LY294002购自Tocrics公司(美国);ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自GibcoBRL公司。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。　　1.2细胞培养及药物处理　　MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37℃、体积分数0.05的CO2条件下培养。当细胞融合达80%～90%时，分别用在有或无LY

7、294002(10μmol/L)存在的情况下，应用Rg1(10-8mol/L)预保护24h,然后再给予6OHDA(100μmol/L)，共分为对照组、6OHDA组、Rg1+6OHDA组及Rg1+LY294002+6OHDA组。　　1.3MTT法检测细胞生长　　将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，在有或者无LY294002共存情况下，先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24h，再用6OHDA处理，24h后去除培养液，加5g/L的MTT20μL，于37℃、体积分数

8、0.05的CO2培养箱继续培养4h，每孔中加DMSO100μL，混匀后用酶标仪检测波长570nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率。　　1.4免疫印迹法检测pAkt和Akt蛋白的表达　　将传代细胞接种于6孔板中，6OHDA组用6OHDA(100μmol/L)处理细胞0.5、1、2、4、6h。Rg1预保护组先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24h，再