人参皂苷rg1激活pi3k-akt信号通路对6ohda毒性作用的影响论文

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1、人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6OHDA毒性作用的影响论文【摘要】目的探讨人参皂苷Rg1对抗6羟基多巴胺(6OHDA)毒性作用的信号通路。方法MES23.5细胞常规培养，免疫印迹法观察人参皂苷Rg1预处理对6OHDA诱导的磷酸化蛋白激酶B(Akt)表达的影响，MTT法观察细胞的存活率。结果6OHDA可时间依赖性地降低MES23.5细胞磷酸化Akt的表达(F=24.51,P0.01)，人参皂苷Rg1预处理可明显增强磷酸化Akt的表达(t=471.60,P0.01);人参皂苷Rg1预处理可明显降低6OHDA对MES23.5细胞的损伤作用，此作用可以被磷脂酰肌醇

2、3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002所阻断(F=25.12,P0.01)。结论人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt信号通路对抗6OHDA对MES23.5神经细胞的毒性作用。【关键词】人参皂甙;羟多巴胺;毒性作用;蛋白激酶B;神经元ABSTRACTObjectiveTostudythesignalingpathethod,andthecellsurvivalobservedbyMTTmethod.Results6OHDAinhibitedtheAktphosphorylationinatimedependentmannerinMES23.5cells(F=24.51

3、,P0.01).Pretreatmententine;Toxicactions;CaseinkinaseB;Neurons帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元功能障碍1,2。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制密切相关。目前对PD的治疗手段不断发展.freela公司(美国);抗Akt抗体购自SantaCruz公司(美国);抗磷酸化Akt抗体购自购自Cellsignaling公司(美国);LY294002购自Tocrics公司(美国);

4、ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自GibcoBRL公司。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。1.2细胞培养及药物处理MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37℃、体积分数0.05的CO2条件下培养。当细胞融合达80%～90%时，分别用在有或无LY294002(10μmol/L)存在的情况下，应用Rg1(10-8mol/L)预保护24h,然后再给予6OHDA(100μmol/L)，共分为对照组、6OHDA组、Rg1+6OHDA组及Rg1+L

5、Y294002+6OHDA组。1.3MTT法检测细胞生长将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，在有或者无LY294002共存情况下，先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24h，再用6OHDA处理，24h后去除培养液，加5g/L的MTT20μL，于37℃、体积分数0.05的CO2培养箱继续培养4h，每孔中加DMSO100μL，混匀后用酶标仪检测波长570nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率。1.4免疫印迹法检测pAkt和Akt蛋白的表达将传代细胞接种于6孔板中，6OHDA组用6OHDA(100μmol/L)处理细胞0.5、1、2、

6、4、6h。Rg1预保护组先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24h，再用6OHDA处理细胞0.5、1、2、4、6h，去掉培养液，收集细胞，2000r/min离心5min，沉淀细胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制剂(2mg/Laprotinin,2mg/Lleupeptin,1mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制剂(1mmol/Lsodiumorthovanadate,.freelmol/LNaF)NonidetP40(20mmol/LTrisHCl,pH7.5;150mmol/LNaCl;1mmol/LCaCl2;1mmol/LM

7、gCl2;体积分数0.10的glycerol;体积分数0.01的NonidetP40)溶液裂解细胞。应用Bradford试剂测定蛋白浓度，取20μg的蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5min，在100g/LSDSPAGE凝胶上电泳，然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。以体积分数0.05脱脂奶粉室温封闭2h后与抗pAkt(1∶1000)或抗Akt(1∶2000)一抗4℃孵育过夜，继以羊抗兔IgGHRP二抗孵育2h，使用ECL化学发光试剂进行检测，用pAkt/Akt