毒热平注射液对病毒感染巨噬细胞irak4表达的影响

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1、毒热平注射液对病毒感染巨噬细胞IRAK4表达的影响作者：张艳丽，李秀萍，王宁萍，李澎涛【摘要】目的研究毒热平注射液对流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1表达IRAK4(IL-1receptorassociatedkinase4,IRAK4)的影响。方法用100TCID50流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1后换用10μg/ml浓度含药维持液继续培养，于12h弃细胞上清液并收集细胞，提取细胞RNA和核蛋白，进行实时定量PCR反应（RT-PCR）和yD88的信号

2、传导通路中IRAK4的表达有关。【关键词】毒热平；流感病毒；巨噬细胞；IRAK4　固有免疫是机体抵御病原生物侵袭的首道防线，有研究表明，机体针对病毒及其他病原生物等病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP)的入侵所产生的固有免疫及适应性免疫由模式识别受体(patternrecognitionreceptors，PRR)启动［1］。其中，TLR7可识别病毒单链RNA，以MyD88依赖的信号通路活化免疫细胞，在介导抗病毒免疫应答中发挥重要的作用［2］。本实验

3、观察毒热平注射液对流感病毒感染后该信号通路中IRAK4信号蛋白的影响。　　1材料　　1.1细胞狗肾细胞株（MDCK）购自军科院细胞室，由本室传代后使用；小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1购自南京凯基生物科技发展有限公司，由本室传代后使用。　　1.2病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)，中国中医药研究院中医所提供，本实验室-76℃保存备用。于九日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为1∶512。　　1.3药物毒热平注射液（DRP），由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉4味药物制成的中药复方注射剂，棕色液体

4、，含生药17.4mg/mL，由广东省康美药业有限公司开发提供。　　1.4试剂Dulbecco'sModifiedEaglemedium培养基（DMEM培养基）和RPMI-1640培养基，为GBICO公司产品；新生牛血清：民海生物公司产品。生长液：含10%新生牛血清的1640培养液；维持液：不含血清而含2μg/ml胰蛋白酶的1640培养液；引物及相关试剂由赛百盛生物公司合成提供；RT逆转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒购自美国应用生物公司。一抗：P65(sc-37

5、2)，Santacruz产品；二抗（抗兔）（ZB-2301）购自北京中山生物技术有限公司。　　2方法　　2.1小鼠巨噬细胞株Ana-1的培养复苏小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1，将细胞混悬于生长液中，37℃5%CO2培养箱培养，次日换液，3d后传代1次，取生长状态良好的Ana-1细胞，消化液作用5min后，弃去消化液，加入适量生长液，吹打细胞，计数并调细胞浓度为3×106/ml，移入12孔板,每孔加细胞悬液1ml，贴壁培养4h后弃去未贴壁的细胞。　　2.2药物细胞毒性实验（MTT比色法）待Ana-1细胞生长状态最好时，

6、用0.02%EDTA和0.5%胰酶消化细胞，用生长液调整细胞至所需浓度，将该细胞液加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养至致密细胞单层。用维持液将毒热平注射液稀释为不同浓度，加入细胞培养板中，100μl/孔，每个药物稀释浓度平行做3个复孔，同时设正常细胞对照。于37℃、5%CO2培养箱中培养72h后，用MTT（终浓度为0.5mg/ml）比色法检测药物对Ana-1细胞的毒性，按Reed-Muench法计算药物最大无毒浓度（TC0）和半数中毒浓度（TC50）。　　2.3病毒感染性测定

7、（TCID50的测定）用无血清DMEM培养液对流感病毒FM1株行连续10倍递次稀释，将各稀释度的病毒接种于3×105/ml的MDCK细胞中，每个稀释度平行做6个复孔，同时设正常细胞对照。37℃吸附2h后吸弃病毒液换用维持液继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变效应，并记录病变程度和孔数，以细胞对照无明显退变，病毒感染细胞病变率达50%及以上的细胞孔为病变孔，细胞病变率小于50%的为非病变孔，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50（mediantissuecultureinfectivedosage）。

8、流感病毒FM1的TCID50=10-4.3。　　2.4毒热平注射液作用于病毒感染的巨噬细胞用维持液稀释100TCID50的流感病毒FM1株，0.5ml/孔于37℃吸附单层Ana-1细胞1.5h后，吸弃病毒液用温浴的PBS清洗细胞2次后，换用10μg/ml的含药维持液作为实验药物组，同时设有正常细胞对照组和病毒对照组，每浓度3个复孔。37℃5%CO2培养箱培养，孵育12h后