基于imagej软件的水稻根毛长度测量

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1、基于ImageJ软件的水稻根毛长度测量付艳茹，须健（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉４３００７０）摘要：以体视镜拍摄的水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）中旱５号（ＺＨ５）和珍汕９７（ＺＳ９７）的主根照片为研究对象，利用图像分析软件ＩｍａｇｅＪ建立了一种全新的水稻根毛长度测量方法。在不同的培养时间和培养条件下，分别对位于水稻主根不同部位根毛的长度进行统计，得到一组最优的水稻根毛的测量方法和测量条件。用所建立的水稻根毛长度测量体系，对两组肉眼观察根毛长度无明显差异的水稻品种进行了测量，结果表明，此种方法可以检测出两

2、个水稻品种间根毛长度的差异。.jyqk∶V）升汞摇晃１５ｍｉｎ，弃去升汞，最后用灭菌水清洗３～５次。将灭过菌的水稻种子横向（胚背向培养基一侧）摆放在１／２ＭＳ培养基上，每皿１０粒。将培养皿封口后竖直向后倾斜１５°～２０°放置，使根能贴在培养基表面生长。２８℃光／暗（１６ｈ／８ｈ）培养或２８℃暗培养２ｄ或３ｄ。２结果与分析２．１水稻根毛的图像采集去掉水稻幼苗培养皿封口膜后背面朝上，用体视显微镜（ＬｅｉｃａＳ８ＡＰＯ；ＣＣＤ：ＤＦＣ２９０）拍照，参数设置为：１×、曝光４４０．３、饱和度０．８５、伽玛１．８４、增益１．８４×

3、。２．２水稻根毛的测量启动ＩｍａｇｅＪ软件，选择Ｆｉｌｅ→Ｏｐｅｎ（图１Ａ）打开所拍摄的水稻主根的体视镜图片；Ａｎａｌｙｚｅ→ＳｅｔＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（图１Ｅ）确定标尺；选择ＲｅｃｔａｎｇｕｌａｒＳｅｌｅｃｔｉｏｎ工具（图１Ｂ），默认设置，将所需测量的部位选定，按键盘上的“Ｃｔｒｌ＋Ｃ”键，将所选区域复制，Ｆｉｌｅ→Ｎｅｗ→ＩｎｔｅｒｎａｌＣｌｉｐｂｏａｒｄ，所复制的区域会作为一个独立的窗口出现；用Ｆｒｅｅｈａｎｄ工具，默认设置，将主根选中（图１Ｃ），选择Ａｎａｌｙｚｅ→Ｍｅａｓｕｒｅ（图１Ｄ）得到主根的面积；选

4、择Ｉｍａｇｅ→Ｔｙｐｅ→８－ｂｉｔ（图１Ｆ）将图像调整为灰度模式；选择Ｉｍａｇｅ→Ａｄｊｕｓｔ→Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（图１Ｇ）通过拖动标杆（图１Ｈ）将根毛和主根选中，然后选择Ａｐｐｌｙ，选择Ａｎａｌｙｚｅ→ＡｎａｌｙｚｅＰａｒｔｉｃｌｅｓ（图１Ｉ）会弹出一个设置框，调整Ｓｉｚｅ（ｐｉｘｅｌ〈２）→１，Ｓｈｏｗ→Ｏｕｔｌｉｎｅｓ→ＯＫ，这时会输出根毛和主根的面积和（图１Ｊ）。根据公式：根毛的平均长度＝（根毛和主根的面积和－主根的面积）／（２×所选区域的长度），得到根毛的平均长度。２．３水稻根毛测量方法的优化以ＺＨ５和ＺＳ９

5、７为材料，选取尖端（从距根毛起始处１ｍｍ开始向上４ｍｍ的区域，图２A白色箭头区域）、基部（从种子端开始向下４ｍｍ的区域，图２B）和整体（基部和尖端根毛的平均值）的根毛长度进行统计。培养条件和时间也做了相应的改变，２８℃光／暗（１６ｈ／８ｈ）培养或２８℃暗培养２ｄ或３ｄ。２．３．１培养条件的确定在光、暗条件下培养２ｄ，分别对根的尖端、基部和整体的根毛长度进行测量。结果表明，在光、暗条件下ＺＨ５和ＺＳ９７两个品种间各个部位的根毛长度差异都极显著，但在光培养条件下两个品种间尖端、基部、整体的Ｐ值（分别为４．００Ｅ－１１、４．

6、０６Ｅ－０８、３．１３Ｅ－１２）远小于暗培养下两个品种间的Ｐ值（分别为５．３Ｅ－０４、２．２５Ｅ－０３、９．２Ｅ－０４），所以选定光培养为进行根毛长度测量的理想条件。２．３．２培养时间的确定分别光培养２ｄ和３ｄ，对根的尖端、基部和整体的根毛长度进行测量。结果表明，光下培养２ｄ和３ｄ时，ＺＨ５和ＺＳ９７两个品种间各个测量部位的根毛长度差异都极显著；但在光培养２ｄ时ＺＨ５种内也有显著性差异（基部的根毛长度和整体的根毛长度相比其Ｐ值为０．０３９），表明光培养２ｄ时根毛的长度尚未稳定，所以选定３ｄ为测量根毛长度所需的培养时间。

7、２．３．３测量部位的确定光培养３d，ＺＨ５和ＺＳ９７种间根毛长度相比，各部位相比差异都极显著，尖端（Ｐ值为１．１９４Ｅ－１２）的差异比整体（Ｐ值为６．７８３Ｅ－０９）和基部（Ｐ值为３．１２６Ｅ－０５）的要更为显著（图３，表１）；ＺＨ５和ＺＳ９７种内根毛长度相比，尖端和基部的根毛长度与整体相比差异都不显著（表１），所以可以用尖端的根毛长度来衡量水稻根毛的长度。由上述结果可以得出，水稻根毛长度测量体系的条件为：水稻光培养３ｄ，以尖端根毛的长度来衡量整体根的根毛长度。２．４水稻根毛测量方法的应用为了验证上述所建立的根毛测量体

8、系是否切实可行，对图４中肉眼所见根毛长度无明显差异的两个水稻品种根毛长度进行了测量，其中A、B、C为同一品种，D、E、F为另一品种。结果显示，图４Ａ～Ｆ的水稻根毛长度分别为１４４．５９５、１７２．８０４、１９７．８４３、２９７．６４８、３５１．７８１、４０５．１５６μｍ。统计分析结果表明，Ａ、Ｂ间Ｐ值为２．４１８Ｅ－０３，Ｂ、Ｃ间