GB-T17999.4-1999 SPF 鸡 琼脂扩散试验

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1、GB/T17999.4-1999前言本标准是在我国建立的琼脂扩散试验(AGP)的基础上，并参照美国SPAFAS公司AGP操作规程编制而成。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为《SPF鸡琼脂扩散试验》。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分:GB/T17999.1-1999SPF鸡红细胞凝集抑制试验;GB/T17999.2-1999SPF鸡血清中和试验;GB/T17999.3-1999SPF鸡血清平板凝集试验;GB/T17999.5-1999SPF鸡酶联免疫吸附试验;

2、GB/T17999.6--1999SPF鸡胚敏感试验;GB/T17999.7-1999SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验;GB/T17999.8-1999SPF鸡试管凝集试验;GB/T17999.9-1999SPF鸡间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位:农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准主要起草人:赵立红、陈德威、张秀美、靳彦华、秦卓明。中华人民共和国国家标准GB/T17999.4一1999SPF鸡琼脂扩散试验SPFchicken--Agargel

3、precipitationtest范围本标准规定了琼脂扩散试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于SPF鸡感染以下病毒后的沉淀抗体的监测:禽流感病毒A型(AvianInfluezaVirusTypeA)、传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus)、传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus)、传染性喉气管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitisVirus),禽痘病毒(FowlPoxVirus)、马立克氏病病毒(Marek'sDiseas

4、eVirus)、禽脑脊髓炎病毒(AvianEncephalomyelitisVirus),网状内皮增生症病毒(ReticuloendotheliosisVirus)、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)(AvianReovirus),禽腺病毒I群(AvianAdenovirusGroupI)、多杀性巴氏杆菌(Paste-11amultocida)2原理琼脂扩散试验是一种沉淀反应伉原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向四周自由扩散，二者互相结合，在最适比例处出现沉淀线。常采用已知抗原检测相应的沉淀抗体.3试剂和材料3.1试剂3.1.1琼扩抗原

5、。31.2阳性血清。3.1.3被检血清。3.1.40.01M,pH7.2,8%氯化钠磷酸缓冲液。3.1.5优质琼脂粉或琼脂糖。3.2材料I2门琼扩板。3.2.2打孔器12.3移液器。4操作程序4.1琼脂板制备1g优质琼脂粉或0.8g一Ig琼脂糖加人100ml,O.0lM,pH7.2,8%氯化钠磷酸缓冲液中(检测禽流感病毒感染时，同0.O1mol/L,pH6.4的800氯化钠磷酸缓冲液配制琼脂)，水浴加热融化，稍凉(60C-65C)，倒入琼扩板内(厚度为3mm)，待琼脂凝固后，4℃冰箱保存备用。4.2打孔用六角形打孔器在琼脂板上按7孔梅

6、花图案打孔，孔径3mm-4mm，孔距3mm用8“针头挑出国家质量技术监瞥局1999一11一10批准2000一04一01实施GB/T17999.4-1999孔内琼脂，挑出时从孔一侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上挑出。4.3封底打孔完毕，封闭孔底将板底部在酒精灯上烘烤，使底部琼脂微溶化即可，也可在琼脂孔底部与板接触处加少量溶化的100琼脂或琼脂糖。4.4加样用移液器滴加抗原干中间孔，周围1,4孔加阳性血清，其余孔加被检血清。加祥时应将孔加满，不应出现凹形面，也不应溢出4.5感作将琼扩板加盖保湿，放于37C温箱内作用24h

7、-72h，观察沉淀线5结果判定5门阳性阳性血清与杭原孔之间有明显沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线，并与阳性血清的沉淀线末端吻合，则被检血清判为阳性。5.2弱阳性被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱阳性(需重复试验)5.3阴性被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性