环孢菌素a两种不同产生菌原生质体的制备和再生

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1、环孢菌素A两种不同产生菌原生质体的制备和再生作者：林永勉郑孝贤郑卫程元荣【摘要】以环孢菌素A两种不同产生菌——雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，开展了原生质体制备和再生条件的研究，并分别实现了两个不同种的菌株原生质体再生。【关键词】环孢菌素A雪白白僵菌茄病镰刀菌原生质体Formationandregenerationofprotoplastsfromtationandregenerationprotoplastsfortsolani,esystemcontaininglyeandsnailase.Theeffectsoffactorssuchasosmoticstabilizers

2、,cultivationtime,temperature,pH,incubationtimeontheformationandregenerationsolani;Protoplast环孢菌素A(cyclosporinA)是由11个氨基酸组成的环肽，已作为高效免疫抑制剂在人体器官移植上广泛应用［1］。1976年瑞士Sandoz公司首次报道了由半知菌属多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)［后更名为雪白白僵菌Beauvcrianivea)］和光泽柱孢菌(Cylindrocarponlucidum)产生的环孢菌素A［2］。此后各国的科学家又陆续报道了由13种其他产生菌，

3、如茄病镰刀菌(Fusariumsolani)和侵菅新赤壳菌(Neocosmosporavarinfecta)等产生环孢菌素A。福建省微生物研究所于1983年首次报道了从我国土壤中筛选到环孢菌素A的产生菌茄病镰刀菌411，在国内率先研制成功环孢菌素A［3，4］。根据Ainsycetes)的丝孢目(Hyphomycetales)和瘤座孢目(Tuberculariales)。这两种产生菌不但在形态、培养特征和生理特性上有所不同，而且在工业化生产工艺和结果各有不同的特点。茄病镰刀菌生产环孢菌素A具有发酵培养基成本低，发酵周期短(5d)的优点，但环孢菌素A效价和组分含量偏低；雪白白僵菌生产

4、环孢菌素A具有环孢菌素A效价和组分含量较高的优点，但发酵培养基成本高，发酵周期长(10～15d)。Kim等［5］利用雪白白僵菌进行种内融合，所获得的依赖LVal和LLeu的融合株环孢菌素A效价高达8920mg/L，但发酵所需的培养基价格昂贵，使用培养基中氨基酸含量高达36g/L，发酵周期长达10～13d。我们设想将两种不同的环孢菌素A产生菌的菌种进行目间原生质体融合，试图筛选出集合两个不同菌种优点的融合子应用于生产，获得提高环孢菌素A生产能力和经济效益的新菌株。本文报道以雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，分别进行原生质体制备与再生条件的研究。1材料和方法1.1菌种茄病镰刀菌S

5、421502和雪白白僵菌X44150均由福建省微生物研究所提供。1.2培养基PDA液体培养基称取20g去皮土豆，切成小块状，加适量水煮30min。用4层纱布过滤，弃去滤渣，于滤液中加入2g葡萄糖，定容到100ml。PDA斜面琼脂培养基100mlPDA液体培养基加琼脂2g进行制备。PDA再生培养基PDA液体培养基，酵母浸汁(膏状)0.3g，KCl3.9g，琼脂2g，定容至100ml。1.3试剂纤维素酶(cellulase)厦门泰京生物技术有限公司；蜗牛酶(snailase)厦门泰京生物技术有限公司；溶壁酶(lye)广东省微生物研究所；二硫苏糖醇(DDT)厦门泰京生物技术有限公

6、司。渗透压稳定剂分别为0.6mol/L的KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、D甘露醇、D山梨醇和蔗糖溶液。1.4原生质体的制备分别挑取一环雪白白僵菌和茄病镰刀菌斜面琼脂培养物接种于PDA液体培养基中，摇瓶装量为40ml/250ml三角瓶，26℃、200r/min培养一定时间后投入若干个直径为0.3mm的玻璃珠，振荡20min。用玻璃砂心漏斗G3过滤。取0.2g湿菌体，加入1ml0.01mol/L的DDT，混匀，静置20min后10000r/min离心10min，弃去上清液，将菌丝体沉淀悬浮于2ml无菌水中，10000r/min离心10min。弃去上清夜，加入1ml不同的酶溶

7、液，混匀，置于28℃水浴锅中，每小时用吸管吹吸3次，血球计数板计数。酶解结束后补加1ml0.6mol/LKCl，吹吸3次，用3层擦镜纸过滤，滤液转入到离心管中。3000r/min离心7min，弃去上清液，将原生质体悬浮于1ml0.6mol/LKCl中，血球计数板计数。1.5原生质体的再生将制备好的原生质体悬浮液用0.6mol/LKCl溶液作适当稀释，于PDA再生培养平板上涂布0.1ml；原生质体再生对照系将原生质体用无菌水进行低渗处理，后涂布于再生培养基上。26℃培养