肺炎链球菌转化模型的建立

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1、肺炎链球菌转化模型的建立作者：赵清，李南，张雪梅，胥文春，朱兴华，张群，尹一兵【摘要】目的：建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型，以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造.方法：分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞，转化外源DNA，获取发生了转化的菌株，通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化；并计数抗生素筛选平板上的转化菌落，比较两者的转化率，以确定更佳的转化模型.结果：肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为（0.89±0.20）％，（0.71±0.10）％，高于既往方法的转化率［分别为(

2、6.2±1.4)×10-3％，(5.7±1.1)×10-3％］，构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株，建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型.结论：改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化，能方便研究者对该菌进行各种遗传操作，为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.【关键词】肺炎链球菌；转化，细菌；感受态　　【Abstract】AIM:ToestablishatransformationmodelofStreptococcuspneumoniae(S.pn)inlaboratorytopromotethetransformatione

3、fficiencyandreconstructitschromosomegenebyimprovingtheprevioustransformationmethod.METHODS:ThepetencecellsofS.pnprovedmethods.AftertheexoticDNAedundercertaincelldensity,thetransformedcoloniesonantibioticplate,ationrate.RESULTS:TheimprovedtransformationmodelofS.pninlaborat

4、oryationrateofS.pn334provedtransformationmodel,odel,provedtransformationmodelcanraisethetransformationrateofS.pn,ococcalpathogenesis.　　【Keyoniae;transformation,bacterial;petence　　0引言　　转化是指细菌在自然生长状态下可自发形成感受态（特指细菌能够摄取外来游离DNA的一种状态），摄取外源性DNA，通过同源重组导致基因发生改变的过程.通过转化可以改造细菌基因，进行功

5、能基因组研究，它是研究肺炎链球菌（S.pn）生物学功能的重要手段.本课题组既往的S.pn实验室转化模型［1］有两大弊端：一是转化效率不稳定；二是感受态开放时间较短，不能满足大规模转化的需要.有研究［2］认为冷刺激可能会延长感受态开放时间，我们据此对既往转化模型进行改良，即冷冻处理细胞后再做转化，以期克服其弊端.　　1材料和方法　　1.1材料S.pn血清4型标准菌株TIGR4(ATCCBAA334)，干粉（美国ATCC微生物菌种保存中心）；S.pn血清3型标准菌株CMCC(B)31203，干粉（中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保存中心

6、）；SⅡ型S.pn(1和2号菌株)由中国医科院提供；主要遗传特征经鉴定合格.C+Y培养基：含5g/LYeast提取物（LacksandHotchkiss,1960）；TSA血平板：含50mL/L兔脱纤维全血.感受态刺激因子（CSP2）由挪威生命科学大学HavarstEInLS教授惠赠；S.pnCP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）由美国Morrison教授惠赠；S.pn1d菌株的基因组DNA(含红霉素抗性基因erm的E断裂基因)由本课题组构建［3］；DNA提取试剂盒（上海华舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；

7、胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）.722分光光度仪（上海仪器分析三厂）；-80℃低温冰箱（日本SANYOMedicalfreezerMDF330型）.　　1.2方法　　1.2.1S.pn的生长曲线绘制挑取S.pn单个菌落接种于C+Y培养基，37℃培养12h，转接于20mLC+Y培养基中，于37℃水浴孵育，从1h后开始在分光光度仪上测菌液A620nm值，之后每隔1h取样1次.以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细菌的生长曲线.　　1.2.2改进的S.pn实验室转化模型的建立　　1.2.2.1改进的S.pn实验室转化模型取冻存于-80℃冰

8、箱的S.pn菌株，培养于CTM培养基（含C+Y培养基，1mmol/LCaCl2，0.1g/LBSA）中，37℃水浴至A550nm＝0.1左右时，将甘油加入上述菌液中，至其终浓度为100mL/L