转化生长因子β1对体外大鼠星形胶质细胞形态及胶质

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1、转化生长因子β1对体外大鼠星形胶质细胞形态及胶质　　【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectoftransforminggroorphologyandglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)expressioninratcerebralcorticalastrocytesinvitro.METHODS:Astrocytesculturedinvitrofreemedium(SFM);TGFβ1treatmentgroupsculturedorphologicalchangeofastrocytesicroscopy

2、,andGFAPmRNAandproteinexpressionsinedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)andEM制成悬液后，调节细胞密度为1×105/cm2，种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中培养.1h后换培养瓶以去除成纤维细胞，随后3d内不要移动培养瓶.3d后换液.培养9～14d，细胞融合后传代.传3代后采用间接免疫荧光法监测星形胶质细胞特异性标志GFAP做细胞鉴定.　　1.2方法取对数生长期的细胞,以1×105/cm2传代于培养瓶中,继续培养至50%~60%融合后,换无血清培养基(serumfree

3、medium,SFM)同步24h,弃SFM,分别加入含0,1,2,4μg/LTGFβ1的SFM，分为4组培养细胞.24h后取出细胞,进行以下检测.相差显微镜下观察细胞形态学变化.　　1.2.1半定量RTPCR以Trizol提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测定A260∶A280=1.8～2.0.RT反应50℃30min，Rtase失活94℃2min.PCR反应条件为:94℃30s→52℃30s→72℃1min→GFAP40个循环,βactin40个循环.GFAP和betaactin的扩增片段分别为694bp和228bp.取PCR扩增产物10g/L琼脂糖凝胶电泳后,用Ch

4、emilnagerTM550型凝胶成像分析仪成像并进行图像分析,获得代表各电泳条带产量的吸光度A值.GFAP和betaactin电泳条带A值的比值为GFAP相对吸光度(relativeabsorbance,RA)值,用以表示GFAPmRNA的相对表达量.　　1.2.2蛋白印迹分析星形胶质细胞被用单去污剂裂解缓冲液溶解，缓冲液包括100mg/LPMSF,1mg/Laprotinin,10g/LTritonX100.细胞溶解产物被以10000g4℃离心10min.蛋白定量用Bradford法测定.相同量的上清液被用于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.被电泳分离的蛋白质被转

5、到PVDF膜.膜用含1g/LTmol/LTrisHCl（pH7.5）和137mmol/LNaCl］室温封闭2h，抗GFAP抗体4℃孵育过夜（一抗1∶300稀释），再用辣根过氧化物酶结合的二抗（1∶6000）室温孵育膜1h，最后用增强化学发光法直观观察.　　2结果　　不同浓度TGFβ1对星形胶质细胞光镜下的形态学变化：TGFβ1孵育后的细胞形态均发生改变，1μg/L组细胞体积变大，胞突肥大，胞体肿胀；2μg/L组由星形或多角形趋于扁平形，细胞体积明显变大，胞突消失.随TGFβ1浓度的升高，4μg/L组细胞形态变化的趋势更明显，细胞胞突消失，细胞膜不完整，细胞失去正常形态（

6、图1）.TGFβ1对星形胶质细胞表达GFAPmRNA的影响(图2):各组GFAPmRNA表达皆呈阳性,而且随着浓度的增加,表达量也增加.TGFβ1对星形胶质细胞表达GFAP蛋白的影响(图3):各组GFAP表达皆呈阳性,而且随着浓度的增加,表达量也增加.　　A:0μg/L;B:1μg/L;C:2μg/L;D:4μg/L.　　　　图1TGFβ1浓度对星形胶质细胞形态的影响（略）　　图2TGFβ1对星形胶质细胞表达GFAPmRNA的影响（略）　　图3TGFβ1对星形胶质细胞表达GFAP蛋白的影响（略）　　3讨论　　　　中枢神经系统的各种损伤及疾病发生后，反应性胶质化形成.星

7、形胶质细胞是组成胶质疤痕的主要胶质细胞成分，主要表现为胞体和突起的肥大,GFAP的大量合成与堆积,而星形胶质细胞的增生只是少数现象.胶质化的星形胶质细胞,形态改变，GFAP过度表达.脑损伤后,可产生各种生长因子及细胞调节因子，包括TGFβ1.TGFβ1刺激细胞外基质(ECM)的产生,抑制蛋白酶和基质酶的活性,从而促进ECM沉积,促进组织损伤后的修复［1］.即TGFβ1是一种重要的调节ECM合成的前纤维化调质［2］.因为参与细胞的生长、分化及组织炎症、损伤修复等多种生物学作用,TGFβ