牙体脱钙法和劈牙取髓法观察牙髓组织中vegf表达

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1、牙体脱钙法和劈牙取髓法观察牙髓组织中VEGF表达【摘要】目的：对牙体脱钙和劈牙取髓法在牙髓血管内皮生长因子(vascularendothelialgromunohistochemicalstainingresultsofvascularendothelialgroandentalpulpbydecalcificationandsplittingteethandexploretheapplicationofdecalcificationinimmunohistochemicalstudyofhumandentalpulp.Methods：Thirtyhealthyandmatu

2、remandibularpremolarsmunohistochemistrystainingrespectivelybydecalcificationandsplittingteeth,producedtethodsunderthemicroscope.Results：Sectionsprocessedmunohistochemicalstudycankeepstructureclear,preserveexperimentresultsobjectiveandisended.　　[Keyandentalpulp;vascularendothelialgro，分别用于HE染

3、色，免疫组织化学染色及阴性对照。Ⅱ组：10%甲醛固定离体牙，3天后取出流水冲洗，金刚砂高速涡轮机沿牙体外形均匀磨除，直至透过牙体硬组织可清晰看见完整的髓腔形态，牙体冠根等厚(约3mm)再固定1天确保牙髓充分固定。取出薄块，流水冲洗，浸泡于EDTA快速脱钙液(购于中杉试剂公司，产品编号ZLI9325)，37℃培养箱中脱钙。待牙体软至扩大针可无阻力穿通时取出，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片时，刀刃与组织包埋块成5°角，自牙根切向牙冠，匀速慢行，厚约5μm。每个标本取3张，用于HE染色，免疫组织化学染色及阴性对照。　　1.3免疫组织化学染色　　免疫组化SP法进行VEGF

4、抗体染色。其中兔抗人VEGF单克隆抗体，免疫组织化学SP检测试剂盒均购于中杉试剂公司;PBS液代替一抗作为阴性对照，阳性对照为中杉试剂公司提供的阳性对照片。染色主要过程：组织切片常规脱蜡，水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，VEGF抗体滴加，DAB显色，水洗，复染和透明，最后中性树胶封固，4℃保存。以胞质和基质染成连续条索状，斑点状或颗粒状棕黄色为阳性染色。　　1.4图像分析和数据统计　　光镜下(×400)，分别对两组切片进行牙髓成纤维细胞计数，每张切片随机选取6个视野，取平均值;利用倒置成像系统和ImageProPlus6.0图像分析软件，对各组成纤维细胞阳性染色部位

5、的平均光密度值(meanopticaldensity,MOD)进行定量分析;采用SPSS15.0软件包对两组成纤维细胞总数、阳性染色数及其MOD分别进行成组设计资料的t检验。　　利用镜下标尺将牙体牙髓联合切片中牙髓由冠到根均分成3个区段，依次为冠1/3，中1/3和根尖1/3。见图1。高倍镜下(×400)，各部分各随机取5个阳性染色视野，选取同张切片的空白区进行校正，分别测量MOD，取其平均值。用SPSS15.0软件作统计分析，对3部分的MOD均值进行单因素方差分析。A：冠1/3;B：中1/3;C：根尖1/3牙髓图1牙体联合切片牙髓分区　　2结果　　2.1染色效果、组织结构及操

6、作时间的比较　　Ⅱ组切片中，组织染色对比度强,牙髓细胞、成牙本质细胞、血管和牙本质、前期牙本质以及牙本质小管等结构清晰可见且各层次过渡明显，易于区分(图2-3)。Ⅰ组切片中，牙髓组织不全，根髓常缺失或与其他牙髓重叠，可以发现各部分组织有不同程度的相互交错，且成牙本质细胞层的完整性破坏严重，几乎不能显示成牙本质细胞层，尤其在牙髓根尖狭窄部位牙髓组织有明显的撕脱现象(图4-5)。在操作时间上，Ⅰ组1～2d可完成HE染色，整个操作过程简单快捷;Ⅱ组需5～7d才能完成联合切片的染色，除常规HE操作步骤外，还需对牙体进行预备、二次固定和脱钙。图2脱钙法牙髓纵断切片(HE×100)d：牙

7、本质;pr：前期牙本质;od：成牙本质细胞;pc：牙髓细胞图3牙体脱钙联合切片(HE×20)图4劈牙法牙髓纵断切片(HE×100)图5劈牙法牙髓切片(HE×20)　　2.2牙髓中成纤维细胞的相关比较　　牙髓VEGF免疫组织化学阳性染色可表达于牙髓细胞、间质细胞和血管内皮细胞，其中血管内皮细胞中呈条索状强阳性染色(图6)，在牙髓及间质细胞中呈颗粒或斑片样表达。染色强度与MOD成正比。图6牙体联合切片牙髓VEGF阳性染色(SP×20)镜下观察，Ⅱ组切片中牙髓成纤维细胞数多且沿髓腔壁带状分布，Ⅰ组切片中牙髓成