青蒿素增敏复方抑制肿瘤细胞增殖及延缓荷瘤裸鼠移植

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1、青蒿素增敏复方抑制肿瘤细胞增殖及延缓荷瘤裸鼠移植【摘要】【目的】提高青蒿素抗肿瘤效率，阐明青蒿素增敏复方的抑瘤增敏机理。【方法】采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各药物对人肝癌细胞株HepG2细胞的生长抑制率;经皮下接种HepG2细胞进行荷瘤裸鼠造模，测定给药15d后瘤体质量，计算抑瘤率。【结果】青蒿琥酯配伍马来酸二乙酯、巯基琥珀酸和氨基三唑后，肿瘤细胞的生长抑制率较相同浓度的青蒿琥酯单方高4384%，抑瘤率较青蒿琥酯单方提高近3倍。HepG2细胞中抗氧化剂含量及抗氧化酶活性测定结果表明，空白组的测定值均高于单方组和复方组，而复方组的测定值低于单方组。【结论】青蒿素

2、增敏复方可能通过降低抗氧化剂含量及抑制抗氧化酶活性发挥抗肿瘤增敏作用。【关键词】青蒿素/药理学;肿瘤/中西结合疗法;增敏;细胞培养;疾病模型，动物;裸鼠青蒿素是从中药青蒿(ArtemisiaannuaL.)中提取的抗疟倍半萜过氧化内酯，其人工半合成衍生物青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚等已广泛用于疟疾治疗。在青蒿素抗疟研究中发现，阿霉素、维生素B2和甲萘酯等自由基引发剂(促氧化剂)与青蒿素有协同抗疟作用，而生育酚、抗坏血酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等自由基清除剂(抗氧化剂)则能降低青蒿素的抗疟作用[1]。当疟原虫的过氧化物酶和过氧化氢酶受到抑制后，青蒿素的疗效则明显提高[2]

3、。因此，自由基引发剂增加或自由基清除剂减少对青蒿素的抗疟活性都有增效作用。　　为提高青蒿素的抗肿瘤效果，本研究以谷胱甘肽(GSH)耗竭剂马来酸二乙酯、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)抑制剂巯基琥珀酸、过氧化氢酶(CAT)抑制剂氨基三唑等自由基清除剂与青蒿琥酯组成抗肿瘤增敏复方，通过体外及体内实验比较复方与单方抑制人肝癌细胞株HepG2增殖及延缓荷瘤小鼠移植肿瘤生长的效果，并初步阐明青蒿琥酯增敏复方增强抗肿瘤效果的作用机制，为青蒿素抗肿瘤的临床应用打下基础。现报道如下。　　1材料与方法　　11药物和试剂青蒿琥酯由桂林南药股份有限公司生产(批号：LA090902)，马

4、来酸二乙酯为东京化成工业公司产品，巯基琥珀酸为Alfa公司产品，氨基三唑为上海精纯试剂有限公司产品，5氟尿嘧啶(5FU)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司，DMEM培养基(低糖)购自Gibco公司，胰酶、胎牛血清均购自TBD公司，蛋白质、GSH含量及GSHPX、CAT活性测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产(批号：20090221)。　　12实验动物和肿瘤细胞株SPF级BALB/cnu裸鼠，雌性，4周龄，体质量16～18g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK粤20060015。人肝癌HepG2细胞株由

5、中山大学提供。　　13主要仪器CK40F200型倒置显微镜(Olympus公司)，Hicro17/17R21/21R型高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司)，MK3型酶标仪(热电上海仪器有限公司)，BS124S型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。　　14MTT比色测定[3]取对数生长期的HepG2细胞，用25g/L胰酶消化为单个细胞，作细胞计数，以培养液稀释为终浓度5×104/mL的单细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养1～2d，待细胞贴壁后，加入

6、100μL终浓度为10-7～10-2mol/L的药物于各孔中保温48h后，每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中保温4h，小心吸掉孔中培养液，加入150μLDMSO，静置10min后，用酶标仪测定490nm处的光吸收值(D490)。　　15GSH含量及GSHPX、CAT活性测定按试剂盒说明书操作。　　16实验动物分组按照随机原则，将裸鼠分为5组：模型组，青蒿琥酯单方组(单方组)，青蒿琥酯+马来酸二乙酯+巯基琥珀酸+氨基三唑复方1、2组(复方1、2组)，阳性对照组(5FU组)，复方1、2组分别皮下(远离肿瘤部位)、瘤下(接

7、近肿瘤部位)注射，每组各5只。　　17癌细胞接种造模[4]用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养HepG2细胞，取对数生长期的培养细胞，以25g/L胰酶消化，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，1000r/min离心5min，收集细胞，用生理盐水悬浮细胞，定容，取02mLHepG2细胞(5×106～6×106/mL)接种于裸鼠颈背部皮下。　　18给药方法接种10d后成瘤体积约100mm3时给药，青蒿琥酯剂量为40mg·kg-1·d-1，马来酸二乙酯剂量为200mg·kg-1·d-1，巯基琥珀酸剂量为20mg·kg-1·d-1，氨基三唑剂