一种海葵溶细胞素srcⅰ结构和功能初步的研究

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1、中山大学硕士学位论文摘要在前人构建了玫瑰红绿海葵酸性细胞毒素基因SrcI的非融合蛋白表达质粒pBV220-SrcI的基础上，成功地在M9培养基中以原核细胞E．coliBL21(DE3)为宿主菌进行了表达，重新摸索了包涵体的洗涤、变性和复性条件以及纯化工艺，获得了高纯度的重组蛋白样品(99％以上)，在此基础上，利用15N．1abeledNH4CI和”C．1abeledGlucose作为宿主菌的碳源和氮源，成功地进行了SrcI蛋白15N单标记以及“N和”C的双标记，为下一步做NMR的结构测定实验打下了坚实的基础。在SrcI蛋白的功能研究方面，我们用

2、光学显微镜观察到了SrcI蛋白在作用于两种肿瘤细胞BEL7402以及U251时，会产生出芽状小泡的现象，测定了该蛋白对这两种肿瘤细胞的半抑制浓度Ic。。然后我们从另一侧面，通过用电镜也直接观察到了SrcI蛋白导致肿瘤细胞出泡的现象，并且从更细微的角度观察到了SrcI蛋白对细胞内线粒体、内质网以及核膜等细胞器的破坏。而在整体动物水平，通过对小鼠移植性肝癌(HepG)的抑制试验，证明了SrcI蛋白对于小鼠的移植性肝癌具有肯定的抑制作用，为同后SrcI在肿瘤治疗方面的应用奠定了基础。利用荧光光谱技术，我们研究了SrcI蛋白在PH7．0条件下与不同的膜

3、脂发生作用以后内源荧光的蓝移变化，指出了其蓝移的不同可能是与蛋白以及膜脂本身的性质有关，同时，以圆二色谱技术探讨了Srcl蛋白在不同PH条件下的稳定性，研究了SrcI蛋白与膜脂结合以后构像的变化，发现在结合膜脂之后，Srcl蛋白的无规卷曲结构减少，而a螺旋和13结构这样的有序结构增加，从侧面说明了SrcI蛋白与膜脂的相互结合，得到了与预期相符的结果。总的来说，本论文在M9培养基中对SrcI蛋白进行发酵与同位素标记，在细胞、动物水平对SrcI蛋白进行了初步的功能研究，同时也考察了蛋白与膜脂的相互作用，并获得了该蛋白分子结构在与膜脂结合时候二级结构

4、变化的初步数据，为进一步进行该蛋白的功能与结构研究打下了坚实的基础。关键词：海葵，海葵溶细胞素，非融合表达，肿瘤细胞，脂质体，荧光光谱，圆二色，核磁共振中山大学硕士学位论文AbstractInthisdissertation,wesuccessfullyexpressedSrcIproteinbylheconstructionofpBV220-SrcInon-fusionexpressionvectorinE．cellBL21(DE3)intheM9medium,Aftercarefullywashinganddenaturing—renatu

5、ringprocess，therecombinantSrcIproteinwaspurifiedbyQSepharoseFastFlowionexchangechromatographandPhenylSepharosehydrophobicinteractionchromatograph．Byusing15N-labeledNH4CIand13C—labeledGlucoseastheonlysourceofthecarbonandnitrogenilltheM9medium，weculturedE．coliBL21(DE3)andsucce

6、ssfullypurifiedthe”N．hbcledSrc1proteinand15N．13C．doublelabeledSrcIprotein,whicharebothnecessaryforNMRexperimentstoelucidatethethreedimensionstructure．Secondly,jIItheinvitrofunctionalresearchofSrcI，wefoundthat，whentheSrc1wasaddedonculturedtumorcells(BEL-7402andU251)，thetumorc

7、ellscreatedmanysmalllipidvesiclesbeforetheydied．ThenWeusedMTTmethodtodeterminetheICs0ofSrcIonBEL-7402andU251．Ontheotherhand，weusedelectronmicroscopetoobservethedamageofthesubeellularstructuresoftumorcellscausedbySrc1．Besidestheinvitroexperiments，wealsotestedtheinvivoeffectof

8、Src1．Byintraperitonealinjection，wefoundthatSrcIhadaffirmatoryeffectontransp