肝康ⅳ号对脂肪肝大鼠肝组织脂质、sod、mda及tgf-β-2c1-含量的影响

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1、湖北中医学院2006届硕士研究生毕业论文湿重，并记录，然后在肝脏最大叶边缘0．5cm处取小块肝组织冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取o。59置于预冷的5ml生理盐水，迅速周内切式匀浆机10000r／min匀浆1O秒／次，间隙30秒，连续3次，碎冰块中制成10％的肝匀浆，再用高速冷冻离心机4℃，3000r／min离心10分钟，取上清3ml密封，一20℃冷存待检。另在肝脏不同部位分别取1x1×O．5cm大小肝组织3块，浸泡于1O％甲醛固定液固定，送病理科检查。3观察指标及检测方法3．1形态学观察3．1．1实验大鼠肝脏的肉眼表现及病理形态学观察方法肉眼表现为取材后直接用肉

2、眼观察，病理形态学先脱水石蜡包埋，切片，HE染色，再光学显微镜观察下观察肝脏组织形态学改变(郧阳医学院附属人民医院病理科协助检测)。3．1．1实验大鼠肝脏病理形态学观察标准及积分标准(参照文献“1)：轻度：光镜下每单位面积1／3以上肝细胞脂肪变；中度：光镜下每单位面积2／3以上肝细胞脂肪变；重度：光镜下几乎所有肝细胞均发生脂肪变；肝细胞脂肪变性：部分肝细胞内虽有少量脂滴沉积，但不足脂肪肝的诊断标准。肝脏肉眼表现积分标准积分O123形态改变状况肝脏外形正常，暗红色，包膜光滑，边缘锐利，质韧肝脏体积增大，呈淡黄色，包膜光滑，边缘锐利，质韧肝脏体积增大，呈黄色，包膜紧

3、张，边缘变钝，质韧肝脏体积增大，呈黄色，包膜紧张，边缘变钝，切面油腻，质软3．2血清AST、ALT、和肝组织TG、TC的检测由郧阳医学院附属人民医院检验科用金自动生化分析仪协助检测。3．3s0D，MDA的检测3．3．1肝组织蛋白含量测定：取10％的肝匀浆lml用生理盐水按1比9稀释成1％的肝匀浆，然后在空白管、标准管和测定管分别加蒸馏水、19／1的蛋白标准液和肝组织匀浆各O．05ml，然后各管均加入考马斯亮兰显色剂3ml，混匀，静置10分钟，于595nm处，1cm光径，空白管调零，测各管吸光度。最后根据公式蛋白含量(g／L)=测定管吸光度／标准管吸光度×标准管浓

4、度(g／L)。3．3．2肝组织s0D测定(黄嘌呤氧化酶法)：取10％的肝匀浆lml用生理盐水按1比9稀释成1％的肝匀浆，在测定管和对照管按试剂说明书逐步添加试剂，取9湖北中医学院2006届颂士研究生毕业论又样量为30ul，待在充分混匀，置37℃恒温水浴40分钾后加显色剂2ml，混匀，室温放置10分钟后，于波长550nm处，1cm光径，空白管调零，测各管吸光度。计算公式soD活力(u／mgprot)=(对照管吸光度一测定管吸光度)／对照管吸光度÷50％×反应液总体积／取样量(m1)÷组织中蛋白含量(mgprot／m1)。3．3．3肝组织MDA测定(硫代巴比妥酸法T

5、BA)：按说明书推荐简便法操作，先配混和试剂，然后在标准管、标准空白管和测定管中分别加入10nmoml／ml的标准品、无水乙醇、10％的肝组织匀浆各o．2ml，最后每管中均加入混和试剂4m1，混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500转／分，离心十分钟，取上清1m1，于波长532nm处，lcm光径，测各管吸光度。计算公式MDA含量(nmol／mgprot)=(测定管吸光度一标准空白管吸光度)／(标准管吸光度一标准空白管吸光度)×标准品浓度(10nmoml／m1)÷组织中蛋白含量(mgprot／m1)。3．4肝组织T

6、GF—p。的检测(免疫组化法)3．4．1检测方法大鼠肝组织常规石腊包埋，切片厚4Hm，采用sABc免疫组织化学染色法进行。阴性对照，以PBs代替一抗，显微镜观察蛋白的表达，采用图像处理系统分析其数目，步骤如下：1)石蜡切片常规二甲苯脱蜡15mln×3次，梯度酒精(无水乙醇，95％，90％，80％，70％)各5min：2)新鲜3％H202灭活内源性酶10min，蒸馏水洗2min×3次；3)将切片置于构橼酸盐缓冲液(pH6．0)中热修复抗原5min×2次，PBs(pH7．4)洗5min×3次：4)滴加5％BsA封闭，室湿20min，甩去多余液体，不洗；5)滴加稀释(

7、1：1oo)的小鼠单克隆抗体，冰箱4℃过夜，PBs洗2min×3次；6)滴如二抗(羊抗鼠IgG)37℃孵育30Ⅲin，PBS洗2mln×3次：7)滴加SABc试剂30min，PBS洗5min×4次：8)滴加DBA，室温下作用5—30min(镜下控制作用时问)。9)苏木素复染；1o)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；11)显微镜下观察并摄片分析。3．4．2免疫组化阳性诊断标准及半定量分析方法TGF—Dt以肝组织有明确棕黄着色或褐色为阳性细胞。每张切片以Bx一60型叭ympus光学显微镜选取5个高倍视野(O．11唧2／高倍视野)后用OlympusBx一50显微

8、摄影系统、美国Palar