埃博霉素的生物合成与埃博霉素d内酰胺衍生物的半合成研究

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1、埃博霉素的生物合成与埃博霉素D内酰胺衍生物的半合成研究阎家麒（湖北荆工药业有限公司，湖北京山431800）摘要粘细菌纤维堆囊菌ATCC15384在发酵培养中使用P450埃博霉素环氧酶的一种抑制剂，该抑制剂特异性抑制epoK基因产物的生成。重组纤维堆囊菌的epoK基因因随机诱变而失活，由于埃博霉素聚酮合酶（PKS）基因编码的改变，生产菌株只产生埃博霉素D和C，而不产生埃博霉素A和B。快速色谱纯化得到埃博霉素D，以其为起始材料采用区域性-立体选择性钯催化大环内酯氮化反应半合成埃博霉素D内酰胺衍生物。关键词埃博霉素D内酰胺衍生物；埃博霉素D；粘细菌纤维堆囊菌；生物合成；埃博霉素

2、基因簇；聚酮合酶埃博霉素(epothilones）是16元大环内酯化合物。它们首先被G..Hofle及其同事从粘细菌纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum,Myxococcales)中分离提取出来[1]，主要成分为埃博霉素A和B，结构式如图1所示。它们在该菌中以2:1的比例产生，被认为是一类新型天然存在的微管解聚抑制剂。尽管在结构上和紫杉醇并不相同，但它们在作为微管聚合和微管稳定剂方面有相似的作用机理。与紫杉醇相比，埃博霉素不但具有水溶性好，注射、口服均可的特点，而且在P-糖蛋白表达型的多药耐药性（MDR）细胞中也维持很大的细胞毒性，埃博霉素被公认为本世纪将取

3、代紫杉醇的最有效的抗癌药物。Fig1StructuresofepothilonesA,BandTaxol作者简介：阎家麒，1939年生，男，辽宁营口市人，教授，中国药学会高级会员，主要研究领域：生物制药和复杂结构天然药物有机合成。联系电话：13469789911，E-mail:yanjiq99@126.com9由于埃博霉素全合成步骤繁琐且产率甚低，凸显生物合成的可实施性。埃博霉素的生物合成屡见报道[2-5]，但产率低微尚无工业化应用价值。目前，已有5种埃博霉素类似物进入II和III期临床试验，它们是埃博霉素B、埃博霉素D、Ixempa（ixabelilone）、ZK-EP

4、O和BMS-310706。埃博霉素D内酰胺衍生物(Aza-epothiloneD)是一种埃博霉素重要的衍生物，实验证明它具有较强的抑制微管解聚功能[6],是一种候选抗癌药物。埃博霉素D内酰胺衍生物结构式如图2：Fig2StructureofAza-epothiloneD作者以粘细菌纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum）ATCC15384为出发菌株，使用一种化学合成的抑制剂，使得epoK基因（P450环氧酶）发生突变，得到一个含有失活epoK基因的纤维堆囊菌突变菌株,在埃博霉素生物合成的后修饰过程中，抑制C12-C13环氧化反应，使得埃博霉素C和D向埃博霉素A

5、和B的转化受到遏制，因而只产生埃博霉素C和D而不产生埃博霉素A和B。然后，以色谱纯化后的埃博霉素D作为起始原料，经区域性-立体选择性三苯基膦钯催化大环内酯氮化反应，促使埃博霉素D开环，得到一种氮酸，再经三甲基膦处理，生成亚氨基正膦，经水解成为氨基酸。最后用HOBt-EDCl促进氨基酸环化反应，得到标的的埃博霉素D内酰胺衍生物。1材料与方法1.1菌种和EpoK抑制剂出发菌株为粘细菌菌株中的纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum）ATCC15384,从美国菌种保藏中心得到。epoK抑制剂为1-(2-甲基-4-噻唑基)-2-甲基己基-1-烯-5-炔-3-乙酸酯，依据

6、文献[8]方法合成。91.2培养基与菌株突变出发菌株接种在固体培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物10g/L,无水葡萄糖5g/L，CaCl2·H2O1g/L,MgSO4·7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L,琼脂粉15g/L。30℃培养5d后，接种至液体发酵培养基。液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物4g/L,无水葡萄糖15g/L，CaCl2·H2O1g/L,MgSO4·7H2O1g/L,Fe-EDTA8mg/L，树脂XAD-1620ml/L。30℃，120r/min，摇床培养4d。

7、加入epoK抑制剂，使终浓度为5.0mmol/L至10.0mmol/L,在30℃下，120r/min，摇床继续培养7d。1.2.1检测培养物中产生的埃博霉素D和埃博霉素C取培养物50ml，用尼龙筛（孔隙150μm）过滤，用少量水冲洗保留在尼龙筛上的树脂，然后与滤膜一起置于50ml离心管中，加入异丙醇10ml，密封。以180r/min摇动1h，将埃博霉素洗涤下来，然后离心分离1.5ml溶液，将约0.8ml上清液用移液管转移到HPLC试管中。依据样品的HPLC分析结果确定埃博霉素C和D。在上述相应菌落的部分平皿上用塑料杯将1cm2