伤科接骨片对家兔骨折模型肾组织转化生长因子β1表达的影响

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1、伤科接骨片对家兔骨折模型肾组织转化生长因子β1表达的影响张继平张奋耿宫丽姚晖邱建文林爱华许碧莲吴铁【摘要】　　【目的】观察伤科接骨片对模型家兔骨折愈合过程中肾组织转化生长因子β1（TGFβ1）表达变化的影响。【方法】选用36只雄性新西兰家兔，均复制成单侧桡骨中上1/3标准骨折模型；随机分为模型对照组和伤科接骨片组，每组18只，每组再分3个亚组，每个亚组6只。术后第2天开始给药，于术后第11、21和35天分别处死各亚组动物，取肾脏，采用免疫组化染色，应用图像分析的方法测定肾组织TGFβ1表达含量。【结果】第11天和第21天时伤科接骨片组肾组

2、织TGFβ1的表达水平均较模型对照组显著提高（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１）；第35天时伤科接骨片组与模型对照组比较差异无显著性意义（Ｐ＞０.０５）。【结论】伤科接骨片促进骨折愈合的作用可能与其调节肾组织TGFβ1表达水平有关。【关键词】伤科接骨片／药理学骨折／中药疗法肾组织／病理学疾病模型动物兔　　伤科接骨片是目前广泛应用于骨伤科临床的中成药，具有活血化瘀、消肿止痛、续筋接骨、补肾壮骨等功能。临床及实验研究已从组织学、组织形态学、生物力学等不同角度证实该药能够促进骨折愈合〔1－2〕。研究表明伤科接骨片可调节骨折模型家兔愈合过程中骨痂中转化生长

3、因子β（TGFβ1）的合成和分泌，其作用在骨折的早、中期明显〔3〕。TGFβ是一族具有多种功能的蛋白多肽，在骨形成和重建过程中协调间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的活动，对骨修复发挥重要作用〔４〕。骨是体内TGFβ最丰富的来源，TGFβ1在骨基质中的含量约占TGFβ总量的80％～90％，体内几乎所有细胞均可合成TGFβ1并表达相关受体，因此在调节骨折愈合过程中，TGFβ1发挥的作用最为重要〔5〕。本研究观察了伤科接骨片对模型家兔骨折愈合过程中兔肾组织中TGFβ1表达含量的影响，现报道如下。　　1材料与方法　　1.1动物5～8月龄雄

4、性新西兰家兔36只，体质量（2.0±0.5）kg〔合格证号：粤监证字2006A006SYXK（粤）20030001，动物环境设施合格证号：SYXK（粤）20030001〕，由广州中医药大学实验动物中心提供。　　1.2药物、试剂与仪器伤科接骨片由大连美罗中药厂生产（批号：200505209）；TGFβ1免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；HPIAS2000多媒体彩色病理图像分析系统（同济千屏影像公司生产）；941395型显微镜（OlympusJapan）。　　1.3骨折模型复制〔6〕用30g/L戊巴比妥钠（1mL/kg）经耳缘静脉

5、麻醉，剪毛后常规消毒铺巾，切开皮肤，分离组织，暴露桡骨，用牙科电钻在右侧桡骨中、上段1/3交界处（即旋前圆肌止点附近）横行锯断一侧骨皮质，造成3mm宽的骨缺损，保留尺骨完整。逐层缝合，包扎伤口，但不固定。骨折术后即肌肉注射青霉素（4×105U/只）,每日1次，共3d，5d后拆除皮肤缝线。　　1.4分组及给药36只造模成功的骨折家兔随机分为模型对照组和伤科接骨片组，每组18只。每组再分3个亚组（分别于术后11、21、35d处死），每个亚组6只。动物单笼饲养，术后第2天开始给药，伤科接骨片组给予含伤科接骨片的饲料（按150mg·kg-1·d-1的药量

6、将药片加入标准颗粒饲料中制成含药饲料）120g，模型对照组给予标准颗粒饲料120g，每天1次，直至处死。　　1.5肾组织标本留取家兔分别于术后第11、21、35天以戊巴比妥钠麻醉后心脏放血处死，腹正中切口取肾脏去包膜，置入Bouin液中固定。　　1.6免疫组织化学染色肾组织固定后，经常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4μm切片，37℃恒温箱过夜；采用链霉亲和素-生物素复合物法（SABC法）检测TGFβ1，切片脱蜡至水，依次经体积分数0.3%H2O2室温15min，复合消化液室温10min，正常血清封闭液37℃、30min，兔抗TGFβ1多克隆抗体（

7、1：150）4℃过夜；生物素化羊抗兔IgG37℃、30min，SABC试剂37℃、30min；33二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精对比染色；脱水、透明、封片；用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，用试剂盒内阳性切片作阳性对照。　　1.7结果判断及图像分析以肾小管间质细胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。将免疫组化切片置显微镜下（×400），对所测视野进行准确定位后由摄像系统提取数值化细胞图像输入病理图像分析系统进行处理，每例随机选取8个完整而不重叠的视野进行定量分析，以TGFβ1蛋白免疫组化反应阳性颗粒的染色强度（灰度值）和阳性颗粒面积与

8、视野面积的阳性面积比率来反映肾组织TGFβ1的表达水平。　　1.8统计学方法采用SPSS11.0软件进行数据的统计分析。　　2结果