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1、多环芳烃的2种单克隆抗体及其免疫学特性 多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs）是指由2个以上芳香环构成的化合物，主要由煤、石油等有机物的不完全燃烧产生。飞机、汽车尾气、城市排放的生活污水及工业废水，甚至是油炸、熏制食品及食品包装材料、玩具、轮胎等塑料橡胶制品中都含有大量的PAHs[1-2].环境中许多种类的PAHs及其代谢物对人类具有潜在的、持续的毒害作用[3-4].美国和欧盟分别将不同种类的PAHs规定为优先控制污染物并规定了限量要求[5-6],我国
2、也颁布了国家标准严格限制饮用水、空气、食品中苯并（a）芘的含量[7-9]. 目前，PAHs定量检测最常用的方法是气相色谱-质谱连用法（gaschromatography-massspectrometry,GC-MS）和高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC），这类方法样品前处理步骤繁琐，检测时间长，很难满足大量样品的快速筛查和检测要求[10-11].国外很早就开始研究PAHs的免疫学检测方法，并建立了PAHs酶联免疫吸附（enzymeli
3、nkedimmunosorbentassay,ELISA）分析方法,研究表明,ELISA方法灵敏度高，操作简便，可与仪器分析方法联合应用，适合对大量样品的快速筛选，实现PAHs的现场监控[12-17].此前，国内也有少量的关于PAHs酶联免疫方法的研究报道，但多采用多克隆抗体。杨丽波等制备了抗萘多克隆抗体，建立了测定水中萘的ELISA检测方法[18].张彦峰等利用自制的多抗血清以间接竞争ELISA法，测定芘的IC50值为0.132mg/L,检出限为0.1mg/L,但并没有对抗血清进行纯化，进一步优
4、化建立完善的检测方法[19]. 本研究在前期成功制备了抗多环芳烃多克隆抗体的基础上[20],制备了针对PAHs的2种单克隆抗体，并对其免疫学特性进行了研究，以期用于不同种类的PAHsELISA检测试剂盒的研制。 1材料与方法 1.1仪器与试剂InfiniteM200酶标仪（TECAN），倒置显微镜（Olympus）。USEPA优先控制的16种PAHs标准品购自百灵威公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）购自Jackson公司。弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、牛血清白蛋白（bo
5、vineserumalbumin,BSA）、HAT培养基、3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（3,3′，5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB）购自于Sigma公司。PEG1500为Roche公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；BCA蛋白测定试剂盒由上海生工生产；抗体亚类测定试剂盒为Southernbiotech（SBA）生产；Balb/c雌性小鼠购于北京实验动物研究中心。 1.2人工抗原的制备和鉴定以芘丁酸（1-pyr
6、enebutyrate,PBA）为半抗原,采用活性酯法分别与BSA和OVA偶联合成免疫抗原和包被抗原，具体方法参见文献[20]. 1.3动物免疫取6~8周龄雌性Balb/c小鼠，内眦取血，分离血清，作为阴性血清。以PBA-BSA（60μg）与弗氏完全佐剂混合后，腹腔免疫。2周后，以PBA-BSA（30μg）加弗氏不完全佐剂再次腹腔免疫。此后，每隔2周以PBA-BSA（30μg）加弗氏不完全佐剂强化免疫。第4次免疫后2周，内眦取血，分离血清，以PBA-OVA为包被抗原，间接ELI
7、SA检测血清中抗体效价。选择抗体效价高的小鼠，以PBA-BSA（50μg）脾内加强免疫，3~4d后取其脾细胞做细胞融合。 1.4细胞融合将对数生长期的Sp2/0细胞与小鼠脾细胞按1∶5的比例混合，1500r/min离心5min.弃上清，轻弹管底使细胞充分散开。将离心管放入37℃水浴中，1min内缓慢加入1ml的50%PEG,静置1min,然后缓慢加入2ml的无血清的DMEM,1500r/min离心5min,弃上清，加入含20%小牛血清的HAT选择培养基，混匀后，接种于含有饲养细胞的96孔培
8、养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养。 1.5杂交瘤细胞株的筛选与克隆融合约10d后，分别以2μg/mlPBA-OVA和BSA包被酶标板，间接ELISA法检测杂交瘤细胞的上清液。有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化，扩大培养后，竞争ELISA方法筛选分泌抗PAHs的单克隆抗体杂交瘤细胞株。 1.6单克隆抗体的制备及纯化采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，将腹水5000r/min离心20min除去细胞和其它沉淀物，硫酸铵-正辛酸初步纯化后，采用ProteinG亲和层析的方
