de流程——永诺生物

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1、第2章6张胶1.蛋白质样品的CyDye荧光标记荧光标记使用CyDyeDIGEFlour(minimalDye)LabellingKit进行,所有涉及Dye的操作在避光条件下进行。1)取出-20℃保存的CyDye试剂盒,室温放置5~8分钟以防开盖时凝露,12000g离心1分钟;2)按照试剂盒说明:每个原始包装管中各有5nmol的粉状Dye,加入5μl无水DMF后震荡30秒、12000g离心30秒,即成1nmol/μl的dyestocksolution;3)按照CyDye最小标记法原则,即400pmol的Dye可以标记50μg的蛋白,根据实验设计计算出

2、所需各种Dye的总量(Cy2、Cy3、Cy5各需2.4nmol);4)以dyestocksolution:无水DMF=2:3的比例,将dyestocksolution稀释成workingdyesolution(400pmol/μl),即workingdyesolution2.4ul加入无水DMF3.6μl,震荡30秒、12000g离心30秒;(注意:各种dye的stocksolution和workingsolution未用完者必须密封后储存于-20℃,stocksolution最多可保存两个月,workingsolution配制好后必须在两周内用完

3、。);5)在每个准备进行标记的样品管中,根据实验设计加入1μlCy3或Cy5的workingdyesolution,在pool管中加入6μl的Cy2workingdyesolution,将所有样品管震荡30秒、12000g离心30秒;6)荧光标记反应在冰浴、避光条件下进行30分钟;7)在每个样品管中加入1μlLysinesolution,在pool管中加入6μlLysinesolution,震荡30秒、12000g离心30秒后,在冰浴中避光静置10分钟以终止标记反应;8)按照实验设计,先将标记好的各个样品混合,然后在每个混合的样品中加入50μgCy

4、2标记的pool样品,震荡30秒、第2章12000g离心30秒后-80℃冻存或直接进行双向电泳;2.3.92-DE和2D-DIGE的第一向等电聚焦电泳(IEF)准备1)IPG胶条的选择:根据先期预实验结果,本研究选择pH4~7,24cm的IPG胶条对样品的蛋白质进行等电聚焦分离;2)准备各种用于不同检测手段的足量蛋白质样品:Deeppurple染色:500μg/样品(按前述荧光标记准备中的pool样品)2D-DIGE荧光检测:150μg/样品(Cy2、Cy3、Cy5标记的混合样品)3)配制Rehydrationbuffer:每100ul的Rehyd

5、rationstockbuffer中加入DTT2.8mg、IPGbuffer(pH4-7)2.3μl、Bromophenolblue第2章solution(1%)0.92μl(用于2D-DIGE时IPGbuffer用量为4.6μl);1)在每个样品管中加入Rehydrationbuffer100μl;2)使用Rehydrationstockbuffer将每个样品的体积补足至460μl,这样每460ul样品中就含有DTT2.8mg、IPGbuffer0.5%(用于2D-DIGE时为1%)、Bromophenolblue0.002%,达到进行IEF的要

6、求;3)所有样品管使用12000g离心8分钟以沉淀可能存在的不溶物,取450μl准备IEF上样。2.3.10第一向IEF(使用再水化上样法)1)检查等电聚焦仪状况,准备洁净的胶条槽(IPGstripholder)以及胶条覆盖液(IPGstripcoverfluid);2)将上述制备的含蛋白质样品的450μlRehydrationbuffer均匀的涂布在胶条槽两电极之间,避免产生间断和气泡;3)取出-20℃保存的IPG干胶条(IPGstrippH4-7),使用镊子从正极(酸性端)开始小心的撕掉保护膜,将IPG胶条的胶面向下,并将其正极端顶至胶条槽正极

7、端,缓缓的把整个胶条放入胶条槽中,检查样品溶液在胶下是否均匀及有无气泡;4)每个IPG胶条上均匀覆盖1ml左右的IPGstripcoverfluid以防电泳时水分蒸发;5)盖上胶条槽盖,再次检查上样情况,并核对样品与相应的IPG胶条编号,(对荧光标记样品的IEF需要加避光罩进行);6)IEF程序设置:Current:50μA/stripStep1:30V,12h,step-n-holdStep2:500V,1h,step-n-holdStep3:1000V,1h,step-n-holdStep4:8000V,12h,step-n-holdTotal

8、:85000Vh第2章1)IEF完成后,IPG胶条-80℃冻存或直接进行第二向电泳;2)及时清洗胶条槽以免残留蛋白质附着于

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