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《非编码rna在胃癌发生发展及胃癌微环境tam中的作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
授予单位代码10089学号或申请号20151014中国图书分类号R735.1HebeiMedicalUniversity博士学位论文学术学位非编码RNA在胃癌发生发展及胃癌微环境TAM中的作用及机制研究研究生：张璁导师：单保恩教授赵连梅副研究员专业：免疫学二级学院：第四医院2018年4月 目录中文摘要················································································1英文摘要················································································7英文缩写··············································································14研究论文非编码RNA在胃癌发生发展及胃癌微环境TAM中的作用及机制研究引言·············································································15第一部分Snord105b在胃癌组织、胃癌患者血清及胃癌细胞系中的表达前言·············································································17材料与方法····································································17结果·············································································23附图·············································································24附表·············································································26讨论·············································································27小结·············································································28参考文献·······································································28第二部分Snord105b对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制研究前言·············································································31材料与方法····································································32结果·············································································44附图·············································································55讨论·············································································68小结·············································································70参考文献·······································································70第三部分Snord105b对裸鼠体内胃癌细胞成瘤能力影响的实验研究前言·············································································73材料与方法····································································73结果·············································································76附图·············································································79讨论·············································································82 小结·············································································83参考文献·······································································83第四部分LncRNA-NR_109861在肿瘤相关巨噬细胞中的表达及在胃癌微环境TAM中作用的实验研究前言·············································································85材料与方法····································································86结果·············································································91附图·············································································97附表············································································104讨论············································································105小结············································································106参考文献······································································107结论···················································································109综述非编码snoRNA结构与功能的研究进展·······························110致谢···················································································127个人简历·············································································128 中文摘要非编码RNA在胃癌发生发展及胃癌微环境TAM中的作用及机制研究摘要第一部分Snord105b在胃癌组织、胃癌患者血清及胃癌细胞系中的表达目的：研究snord105b在胃癌组织、胃癌患者血清及胃癌细胞系中的表达水平，并分析胃癌组织中snord105b的表达水平与胃癌患者临床病理参数的相关性。方法：1应用RT-qPCR法检测胃癌组织及相应癌旁正常组织中snord105b的表达水平，并分析snord105b的表达水平与胃癌患者临床病理参数的相关性。2应用RT-qPCR法检测胃癌患者和正常献血者血清中snord105b的表达水平。3应用RT-PCR和RT-qPCR法检测胃癌细胞系中snord105b的表达水平。结果：1.RT-qPCR方法分析结果显示，与相应正常胃粘膜组织相比，胃癌组织中snord105b表达上调，其表达水平与患者肿瘤大小、分化程度和TNM分期呈正相关（P<0.05）。2.RT-qPCR方法分析结果显示，与正常献血者相比，胃癌患者血清中snord105b表达上调（P<0.05）。3.RT-qPCR和RT-PCR方法分析结果显示，与正常胃上皮永生化细胞（immortalizednormalgastricepithelialcellline,GES-1）相比，snord105b在五种胃癌细胞系中表达水平有不同程度升高（P<0.05）。第二部分Snord105b对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制研究目的：研究snord105b对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等能力的影响，并探讨snord105b在胃癌细胞中发挥作用的可能机制。方法：1 中文摘要1应用MTS、Transwell小室、Matrigel基质胶、划痕愈合和克隆形成实验检测，敲低或者过表达snord105b基因后对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力的影响。2应用流式细胞技术检测，敲低或过表达snord105b基因后对胃癌细胞周期及凋亡的影响。3应用Western-blot方法检测，敲低或过表达snord105b基因后对胃癌细胞侵袭、周期和凋亡相关蛋白表达的影响。4应用RNA-ChIRP法检测胃癌细胞中与snord105b相互作用的蛋白，并用质谱分析所得的差异条带，选择人果糖二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphatealdolaseA,ALDOA）进行深入研究。5应用western-blot和RIP实验验证ALDOA蛋白与snord105b基因的相互作用关系。6应用western-blot法验证，敲低或过表达snord105b基因后，胃癌细胞中ALDOA、C-myc以及E-Cadherin、Vimentin及N-Cadherin蛋白表达的变化。7应用RT-qPCR法检测，敲低或过表达snord105b后，胃癌细胞中ALDOA表达水平的变化。8应用MTS、Transwell和western-blot方法检测，同时敲低snord105b和过表达ALDOA，对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，以及C-myc蛋白表达水平的影响。结果：1.MTS法检测结果显示，敲低snord105b基因表达能够抑制胃癌细胞的增殖能力（P<0.05），而过表达snord105b基因可促进胃癌细胞的增殖能力（P<0.05）。2.Transwell小室和Matrigel基质胶实验结果显示，敲低snord105b基因表达能够抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05），过表达snord105b能够促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）。3.划痕愈合实验结果显示，敲低snord105b基因表达能够抑制胃癌细胞的划痕愈合能力（P<0.05），过表达snord105b能够促进胃癌细胞的划痕愈合能力（P<0.05）。4.克隆形成实验结果显示，敲低snord105b基因表达能够抑制胃癌细2 中文摘要胞的克隆形成能力（P<0.05），过表达snord105b能够促进胃癌细胞的克隆形成能力（P<0.05）。5.流式细胞技术分析结果显示，敲低snord105b基因表达可缩短胃癌细胞周期S期，发生G0/G1期阻滞，并促进其细胞凋亡（P<0.05）。6.Western-blot法分析结果显示，敲低snord105b基因表达，胃癌细胞中促凋亡蛋白BAX表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4表达降低，侵袭蛋白MMP2表达降低（P<0.05）；过表达snord105b基因，胃癌细胞中促凋亡蛋白BAX表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4表达升高，侵袭蛋白MMP2表达升高（P<0.05）。7.RNA-ChIRP（Chromatin/ProteinisolationbyRNApurification）实验联合质谱分析，以及Western-blot和RIP验证结果显示，snord105b可与ALDOA蛋白发生相互作用。8.Westernblot实验结果显示，敲低snord105b基因表达能够抑制胃癌细胞中ALDOA、C-myc及EMT相关蛋白表达，而过表达snord105b能促进胃癌细胞中ALDOA、C-myc及EMT相关蛋白表达（P<0.05）。9.RT-qPCR法分析结果显示，敲低或者过表达snord105b基因对ALDOA基因表达水平无影响（P>0.05）。10.Rescue实验利用MTS、Transwell小室、Matrigel基质胶及western-blot法检测结果显示，同时敲低snord105b和过表达ALDOA基因可部分恢复胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及C-myc蛋白的表达水平（P<0.05）。第三部分Snord105b对裸鼠体内胃癌细胞成瘤能力影响的实验研究目的：研究在裸鼠体内snord105b对胃癌细胞增殖能力的影响，并进一步探讨snord105b在胃癌细胞中发挥作用的可能机制。方法：1用慢病毒侵染方法构建稳定低表达snord105b的胃癌细胞株SGC-7901，RT-qPCR方法检测转染效率，并建立裸鼠皮下移植瘤模型。2检测sh-snord105b-SGC-7901和sh-nc-SGC-7901细胞在裸鼠体内的生长情况，并测量各组裸鼠肿瘤的大小。3 中文摘要3RT-qPCR方法检测裸鼠移植瘤组织中snord105b表达水平，western-blot方法检测裸鼠移植瘤组织中ALDOA蛋白的表达水平。4应用免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤组织中ALDOA、C-myc和EMT相关蛋白的表达水平。结果：1.免疫荧光和RT-qPCR法分析结果显示，成功构建稳定低表达snord105b的胃癌细胞株SGC-7901（P<0.05）。2.裸鼠成瘤实验结果显示，敲低snord105b基因表达后，sh-snord105b-SGC-7901细胞在裸鼠体内形成的移植瘤体积减小，重量明显减轻（P<0.05）。3.RT-qPCR结果显示，裸鼠移植瘤组织中snord105b表达水平降低，western-blot方法分析结果显示，裸鼠移植瘤中ALDOA蛋白的表达水平降低（P<0.05）。4.免疫组织化学法分析显示，敲低snord105b基因表达组裸鼠移植瘤组织中ALDOA、C-myc、Ki-67、Vimentin、N-Cadherin蛋白表达水平降低，E-Cadherin蛋白表达升高（P<0.05）。第四部分LncRNA-NR_109861在肿瘤相关巨噬细胞中的表达及在胃癌微环境TAM中作用的实验研究目的：寻找M2型巨噬细胞中差异表达的lncRNA（与M0细胞相比），探索其在肿瘤相关巨噬细胞（Tumorassociatedmacrophage,TAM）极化过程中的作用，及其通过调控TAM极化对胃癌细胞生物学功能的影响。方法：1利用PMA及各种细胞因子处理THP-1细胞，建立M0、M1和M2型巨噬细胞模型。2运用RT-qPCR和FCM方法检测各种巨噬细胞分子标志物的表达变化。3运用ELISA方法检测各种巨噬细胞培养上清中细胞因子的表达变化。4运用基因芯片技术分析与M0型巨噬细胞相比，M2型巨噬细胞中差异表达的lncRNA，并根据lncRNA数据库分析选择NR_109861进行深4 中文摘要入研究。5运用RT-qPCR方法检测，人外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）源性的M2巨噬细胞中NR_109861的表达水平。6运用RT-qPCR方法检测，胃癌组织TAM及相应正常组织TAM中NR_109861的表达水平。7运用RT-qPCR方法检测，敲低NR_109861基因表达后M2型巨噬细胞分子标志物表达的改变。8运用ELISA方法检测，敲低NR_109861基因表达后，M2型巨噬细胞培养上清中细胞因子表达的改变。9运用MTS方法检测，30%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清（30%MCMsi-1/si-2），对胃癌细胞增殖能力的影响。10运用Transwell小室实验检测，敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞（M2si-1/si-2），或者30%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清（30%MCMsi-1/si-2）对胃癌细胞迁移能力的影响。结果：1.RT-qPCR和FCM实验结果显示，与M0细胞相比，THP-1诱导的M1型巨噬细胞高表达M1型分子标志物（P<0.05）；而THP-1诱导的M2型巨噬细胞高表达M2型分子标志物（P<0.05）。2.ELISA实验结果显示，与M0细胞培养上清相比，M1细胞培养上清中高表达细胞因子IL-12和TNF-α（P<0.05），M2细胞培养上清中高表达细胞因子IL-10和TGF-β（P<0.05）。3.基因芯片分析结果显示，M0与M2型巨噬细胞之间有945条差异表达的lncRNA，根据lncRNA数据库分析，我们选择NR_109861进行深入研究。4.RT-qPCR法分析结果显示，PBMC源性的M2型巨噬细胞高表达NR_109861（P<0.05），且胃癌组织TAM中NR_109861表达明显升高（P<0.05）。5.RT-qPCR法分析结果显示，敲低NR_109861基因表达，M2型巨噬细胞中M2型分子标志物表达降低（P<0.05），而M1型分子标志物表达升高（P<0.05）。6.ELISA法分析结果显示，敲低NR_109861基因表达，M2型巨噬细5 中文摘要胞培养上清中，IL-10和TGF-β表达水平降低（P<0.05），且IL-12和TNF-α表达水平升高（P<0.05）。7.MTS法分析结果显示，与对照组（30%MCMsi-nc）相比，30%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清（30%MCMsi-1/si-2），可抑制胃癌细胞的增殖能力（P<0.05）。8.Transwell小室检测结果显示，与对照组（M2si-nc/30%MCMsi-nc）相比，敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞（M2si-1/si-2），或者30%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清（30%MCMsi-1/si-2），可抑制胃癌细胞的迁移能力（P<0.05）。结论：1.Snord105b基因在胃癌组织、胃癌患者血清和胃癌细胞系中表达升高，且胃癌组织中snord105b基因的表达水平与肿瘤大小、分化程度及肿瘤分期相关。2.Snord105b基因通过多种方式促进胃癌的进展：snord105b基因可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。敲低snord105b基因表达可增加胃癌细胞早期凋亡，并缩短细胞周期S期，发生G0/G1期阻滞。此外，裸鼠成瘤实验表明，敲低snord105b基因表达可抑制胃癌细胞在裸鼠体内的增殖能力。3.Snord105b基因可能通过与ALDOA蛋白相互作用，影响致癌因子C-myc蛋白的表达，进而促进胃癌细胞发生EMT，导致胃癌进展。4.利用THP-1细胞成功构建M0、M1和M2型巨噬细胞模型。5.基因芯片杂交结果显示LncRNA-NR_109861在M2型巨噬细胞中表达明显升高。且在PBMC来源的M2型巨噬细胞，以及胃癌组织来源的TAM中表达均升高。6.在M2型巨噬细胞中，敲低NR_109861基因表达，可改变巨噬细胞的极化特性。在胃癌微环境中TAM中，降低NR_109861基因表达，可以抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。关键词：胃癌，snord105b，ALDOA，EMT，肿瘤相关巨噬细胞，NR_1098616 英文摘要Thefunctionandmechanismofnon-codingRNAsinthedevelopmentofgastriccancerandTAMsofGCmicroenviromentABSTRACTPartoneTheexpressionofsnord105binthetissues,seraandcelllinesofgastriccancerObjective:Toinvestigatetheexpressionofnon-codingRNA-snord105binthetissues,seraandcelllinesofgastriccancer(GC).Methods:1Expressionofsnord105binGCtissuesandnon-cancertissueswasdetectedbyRT-qPCR.Thecorrelationbetweensnord105bandclinicpathologicalcharacteristicsofpatientswithGCwasanalyzed.2Expressionofsnord105binseraofhealthydonorsandGCpatientswasdetectedbyRT-qPCR.3Expressionofsnord105binGCcelllineswasdetectedbyRT-PCRandRT-qPCR.Results:1.RT-qPCRassaydemonstratedthattheexpressionofsnord105binGCtissueswassignificantlyhigherthanthatofnon-cancertissues(P<0.05).Expressionlevelofsnord105bwasassociatedwithtumorsize,differentiationandTNMstages(P<0.05).2.RT-qPCRassayrevealedthattheexpressionofsnord105bintheseraofGCpatientswashigherthanthatofhealthydonors(P<0.05).3.RT-PCRandRT-qPCRassaysuggestedthatcomparedwithGES-1,theexpressionofsnord105bwassignificantlyhigherinGCcelllines.ParttwoThefunctionandmechanismofsnord105binGCcellsObjective:Toinvestigatetheeffectsofsnord105bonproliferation,migrationandinvasionofGCcells.Toexplorethepossiblemolecular7 英文摘要mechanismofsnord105binGCcells.Methods:1MTS,transwellandMatrigelassayswereusedtodetectthecellproliferation,migrationandinvasionabilitiesofGCcellswithsnord105blow-expressionorforced-expression,respectively.2FlowcytometryassaywasusedtodetectcellcycleandapoptosisofGCcellswithsnord105blow-expression.3Western-blotwasperformedtodetecttheexpressionofmetastasis-related,cellcycle-relatedandapoptosis-relatedproteinsofGCcellswithsnord105blow-expressionorforced-expression.4RNA-ChIRPassaycombiningwithmassspectrometrywereperformedtodetectthesnord105b-bindingproteinsinSGC-7901cells,andtheproteinALDOAwaschosenforfurtherstudy.5Western-blotandRIPassayconfirmedALDOAwasinteractedwithsnord105b.6Western-blotwasusedtodetecttheexpressionofALDOA,C-myc,andEMT-relatedproteinsinGCcellswithsnord105blow-expressionorforced-expression.7RT-qPCRwasperformedtotesttheexpressionofALDOAinGCcellswithsnord105blow-expressionorforced-expression.8MTS,transwell,matrigelandwestern-blotassayswereperformedtodetecttheproliferation,migration,invasionandtheexpressionofALDOAinGCcellswithsnord105blow-expressionandALDOAforced-expression.Results:1.MTSassaydemonstratedthatknockdownofsnord105bcouldsuppresstheproliferationofGCcells(P<0.05),whileforced-expressionofsnord105bcouldpromotetheproliferationofGCcells(P<0.05).2.TranswellandMatrigelassaysshowedthatknockdownofsnord105binhibitedmigrationandinvasionofGCcells(P<0.05),whileforced-expressionofsnord105bpromotedmigrationandinvasionGCcells(P<0.05).3.Thewoundhealingassaydemonstratedthatknockdownofsnord105b8 英文摘要coulddecreasethewoundhealingabilitiesofGCcells(P<0.05),whileforced-expressionofsnord105bcouldincreasethewoundhealingabilitiesofGCcells(P<0.05).4.Thecolonyformationassayshowedthatknockdownofsnord105bcoulddecreasethecolonyformationabilitiesofGCcells(P<0.05),whileforced-expressionofsnord105bcouldincreasethecolonyformationabilitiesofGCcells(P<0.05).5.Flowcytometryanalysisrevealedthatcomparedwiththesi-ncgroup,theapoptosiswassignificantlyincreasedinGCcellswithsnord105bknockingdown(P<0.05).Inaddition,comparedwiththesi-ncgroup,therewasareducedrelativeproportionofSphaseinGCcellswithsnord105bknockingdown(P<0.05).6.Western-blotassayshowedthatknockingdownofsnord105b,theexpressionofapoptosis-relatedproteinBAXwasincreased,whileBcl-2wasdecreased.Thecellcycle-relatedproteinCyclinDandCDK4weredecreasedandthemetastasis-relatedproteinMMP2wasdown-regulated.Over-expressionofsnord105b,theexpressionofapoptosis-relatedproteinBAXwasdecreased,whileBcl-2wasincreased.Thecellcycle-relatedproteinCyclinD1andCDK4wereincreasedandthemetastasis-relatedproteinMMP2wasup-regulated(P<0.05).7.RNA-ChIRPassayassociatedwithmassspectrometrysuggestedthatALDOAwasboundtosnord105b.Western-blotandRIPassaywereusedtoverifythisresult(P<0.05).8.Western-blotshowedthatknockingdownofsnord105b,theexpressionofALDOA,C-myc,VimentinandN-Cadherinweredown-regulated,whiletheexpressionofE-Cadherinwasup-regulatedinGCcells.Up-regulatingofsnord105b,theexpressionofALDOA,C-myc,VimentinandN-Cadherinwereincreased,whiletheexpressionofE-CadherinwasdecreasedinGCcells(P<0.05).9.RT-qPCRdemonstratedthattherewerenocorrelationsbetweentheexpressionofsnord105bandALDOAinGCcells(P>0.05).9 英文摘要10.MTS,transwell,matrigelandwestern-blotassaysdemonstratedthatknockdownofsnord105bandoverexpressionofALDOAcouldpartlyrescuetheproliferation,migration,invasionandexpressionofC-mycinGCcells(P<0.05).PartthreeKnockingdownsnord105binhibitedthegrowthofGCcellsinvivoObjective:Toinvestigatetheeffectsofsnord105bonproliferationofGCcellsinvivo.Methods:1XenografttumormodelinnudemicewasestablishedbySGC-7901cellswhichstablytransfectedwithalentivirusconstructcontainingsnord105blow-expression.2Theproliferationoftumorswasobservedandmeasuredeverytwodays.3RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofsnord105bintransplantedtumors,andwestern-blotwasusedtodetecttheexpressionofALDOAintransplantedtumors.4ImmunohistochemicalassaywasperformedtodetecttheexpressionofALDOA,C-myc,Ki-67andEMT-relatedproteinsinthetransplantedtumorofnudemice.Results:1.RT-qPCRshowedtheSGC-7901cellswithstablelow-expressionofsonrd105bwasestablished(P<0.05).2.Theexperimentalresultsshowedthatcomparedwiththesh-ncgroup,thesizeandweightoftransplantedtumorsweresignificantlysuppressedinsh-snord105bgroup(P<0.05).3.RT-qPCRdemonstratedthatcomparedwiththesh-ncgroup,theexpressionofsnord105bwasdecreasedinthesh-snord105bgroup.Western-blotsuggestedthattheexpressionofALDOAwassignificantlydown-regulatedinthesh-snord105bgroup.4.Immunohistochemicalassayshowedthatcomparedwiththesh-ncgroup,10 英文摘要theexpressionofALDOA,C-myc,ki-67,VimentinandN-Cadherinwassignificantlyreduced,whiletheexpressionofE-Cadherinwasup-regulatedinthetumorsafterknockingdownsnord105b.PartfourTheexpressionandfunctionoflncRNA-NR_109861intumorassociatedmacrophagesandmicroenviromentofgastriccancerObjective:TofindthedifferentiallyexpressedlncRNAsinM2macrophages,andtoexploreitsroleinthepolarizationofTAM,andintheeffectsofthebiologicalfunctioninGCcellsbyinfluencingthepolarizationofTAM.Method:1PMAandsomecytokineswereusedtoconstructthemodelofM0,M1andM2macrophagesinTHP-1cells.2RT-qPCRandFCMassaywereperformedtodetectthemarkersofmacrophages.3ELISAwasusedtotesttheexpressionofcytokinesinthesupernatantofmacrophages.4MicroarraywasperformedtosearchforthedifferentiallyexpressedlncRNAsinM2andchosenNR_109861forfurtherstudy.5RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofNR_109861inM2derivedfromPBMCandPBMC.6RT-qPCRwasusedtodetecttheexpressionofNR_109861inTAMsofGCtissuesandnon-cancertissues.7RT-qPCRwasperformedtotesttheexpressionofthemarkersonM2withtheNR_109861knockingdown.8ELISAwasusedtodetecttheexpressionofcytokinesinthesupernatantofM2withNR_109861knockingdown.9MTSwasusedtotesttheproliferationofGCcellsculturedin30%supernatantofM2withNR_109861knockingdown.10TranswellwasperformedtodetectthemigrationofGCcells,whichwereco-culturedwith30%supernatantofM2withNR_109861knockingdown,11 英文摘要orM2withNR_109861knockingdown.Results:1.RT-qPCRshowedthattheexpressionofM1markerswassignificantlyincreasedinM1,andtheexpressionofM2markerswassignificantlyincreasedinM2(P<0.05).FCMfurtherdocumentedthattheCD86/CCR7werehighlyexpressedinM1andCD206/CD163werehighlyexpressedinM2(P<0.05).2.ELISAshowedthattheexpressionofIL-12andTNF-αwasobviouslyincreasedinM1supernatant,whiletheexpressionofIL-10andTGF-βwassignificantlyup-regulatedinM2supernatant(P<0.05);3.MicroarrayshowedthedifferentiallyexpressedlncRNAsandwechoseNR_109861forfurtherstudy.4.RT-qPCRshowedthattheexpressionofNR_109861wasobviousincreasedinM2derivedfromPBMC(P<0.05)andTAMsderivedfromGCtissues(P<0.05).5.RT-qPCRshowedthattheexpressionofM2markerssuchasArg-1,CD206andCCL22wasdownregulatedinM2withNR_109861knockingdown(P<0.05),whiletheexpressionofM1markerssuchasHLA-DRα,CCL5andIL-12wasupregulatedinM2withNR_109861knockingdown(P<0.05).6.ELISAshowedthattheexpressionofIL-10andTGF-βwasdownregulated,whiletheexpressionofIL-12andTNF-αwasupregulatedinM2withNR_109861knockingdown(P<0.05).7.MTSassayshowedthattheproliferationofGCcellswasinhibitedbyculturingin30%supernatantofM2withNR_109861knockingdown,comparedwiththatin30%supernatantofM2(P<0.05).8.Transwellassaydemonstratedthatcomparedwiththesi-ncgroup,themigrationofGCcellswasinhibitedbyculturingwithM2withNR_109861knockingdown(P<0.05),orwith30%supernatantofM2withNR_109861knockingdown(P<0.05).Conclusion:1.Theexpressionofsnord105bwassignificantlyincreasedinGCtissues12 英文摘要andassociatedwiththetumorsize,differentiationandstages.2.Snord105bcouldenhancetheproliferation,migration,invasionandSstageofcellcycleofGCcellsandinhibittheapoptosisofGCcellsinvitroexperiments.Moreover,snord105bcouldpromotetheproliferationofGCcellsinvivo.3.Inaddition,snord105bmayinteractwithALDOA,increasetheexpressionofC-mycandaffectEMT-relatedproteinstopromotethedevelopmentofGC.4.M0,M1andM2macrophageswereconstructedbyTHP-1cells.5.ThemicroarraywasfoundthatthetheexpressionoflncRNA-NR_109861wasobviouslyupregulatedinM2macrophages(TAMs)derivedfromTHP-1cells,PBMCandTAMsinGCtissues.6.KnockingdownofNR_109861inM2macrophageswouldchangethepolarizationofmacrophages.Intheco-culturesystem,knockingdownofNR_109861inM2macrophageswouldinhibittheproliferationandmigrationofGCcellsbydecreasingtheexpressionofmarkersandcytokinesofM2.Keywords:Gastriccancer,Snord105b,ALDOA,EMT,TAM,NR_10986113 英文缩写英文缩写英文缩写英文全称中文全称SnoRNASmallnucleolarRNA核仁小RNAALDOAFructoseBisphosphate果糖二磷酸醛缩酶AsiRNASmallinterferingRNA小干扰RNAncRNANoncodingRNA非编码RNAGCGastriccancer胃癌ChIRPChromatinisolationbyRNARNA纯化染色质分purifycation离技术RIPRNAbindingproteinRNA免疫共沉淀immuneprecipationPIPropidiumiodide碘化丙啶LncRNALongnon-codingRNA长链非编码RNATAMTumorassociatedmacrophage肿瘤相关巨噬细胞PMAPhorbol-12-myristate-13-acetate佛波酯IL-12Interleukin-12白介素-12IL-10Interleukin-10白介素-10TNF-αTumorNecrosisFactor-α肿瘤坏死因子-αTGF-βTumorGrowthFactor-β肿瘤生长因子-βIL-4Interleukin-4白介素-4LPSLipopolysaccharide脂多糖IFN-γInterferon-γ干扰素-γHLAHumanleukocyteantigen人类白细胞抗原CDClusterofdifferentiation分化抗体群INOSInduciblenitricoxidesynthase诱导型一氧化氮合酶Arg-1Arginase1精氨酸酶CCL5Chemokineligand5趋化因子5PBMCperipheralbloodmononuclearcell外周血单个核细胞GM-CSFgranulocyte-macrophagecolony粒细胞巨噬细胞集落stimulatingfactor刺激因子14 研究论文非编码RNA在胃癌发生发展及胃癌微环境TAM中的作用及机制研究引言胃癌是全球发病率第四、死亡率第二的常见消化道恶性肿瘤。在中国，每年新发病例约40万，占世界总发病例数的42%，呈现高发、逐年增加[1,2]并且年轻化的趋势，成为严重危害人民健康的重大疾病之一。胃癌病因和病理机制较为复杂，环境污染、感染和遗传等因素是主要病因。大多数早期胃癌没有明显的临床症状，缺乏特异性生物标志物和有效的治疗手段。分子信号调控网络异常是胃癌发生发展的分子生物学基础，同时也是[3,4]确定精准治疗靶点和策略的切入点。近年来，越来越多的研究者发现非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA），包括miRNA、lncRNA、snoRNA和circRNA等，通过影响胃癌细胞增殖、分化和凋亡等特性，促进胃癌进展。在这些非编码RNA中，snoRNA的研究相对较少，作用机制并不十[5-7]分清楚，值得科研工作者的关注。2012年，Nature杂志文章详细介绍了核仁小RNA（smallnucleolar[8]RNA,snoRNA）的结构及其在肿瘤中的作用。SnoRNA是一类聚集于细胞核仁区，长度在60-300nt的长链非编码RNA，其与某些蛋白质，如非组蛋白染色体蛋白2-1类（NHP2L1），核仁蛋白5A（NOP56），核仁蛋白5（NOP58）和纤维蛋白（fibrillarin）等结合，形成核仁小核糖核蛋白[9]（snoRNP），能在血清中稳定存在且避免被降解。人类snoRNA多数由内含子编码，根据其保守序列，snoRNA被分为C/DboxsnoRNAs或者H/ACAboxsnoRNAs。C/DboxsnoRNAs可与rRNA中长度约10-20nt的保守核心序列结合，参与核糖体的形成加工过程，指导靶核糖残基2′-O-甲基化修饰，并且在选择性mRNA前体剪接过程中发挥重要作用，参与[10]核酸调控。与正常细胞相比，肿瘤细胞需要合成更多的rRNA和蛋白质，由于snoRNA在rRNA的合成加工过程中起重要作用，snoRNA的异常表[11]达与肿瘤的发生密切相关。Snord105b是C/DboxsnoRNA家族成员之一，其宿主基因PPAN在细胞生长和增殖中发挥重要作用。但是snord105b的生物学功能及作用机制不清，需要进一步研究。15 研究论文胃癌微环境（Tumormicroenvironment，TEM）异常是胃癌复发、侵袭和转移的物质基础，同时也是我们有的放矢地确定治疗靶点的切入点。肿瘤微环境由成纤维细胞、内皮细胞、造血细胞和免疫细胞等组成，其中免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞（Tumorassociatedmacrophage,TAMs）[12,13]是组成肿瘤微环境的重要成分。TAMs主要分为两种类型，即主要存在于肿瘤早期，发挥抗肿瘤作用的M1型，和主要存在于肿瘤晚期，促进[14]肿瘤进展的M2型。因此，TAMs在M1和M2型之间的极化改变决定[15,16]肿瘤的转归。因此，探讨胃癌中TAMs的转变机制和其对胃癌细胞生物学行为的影响，对于胃癌的分子靶向治疗有着重要的意义。然而，TAMs的极化机制尚未完全清楚，有待进一步研究。LncRNA（long-noncodingRNA）是一种长度超过200nt不编码蛋白质的长链非编码RNA。lncRNA能在表观遗传、转录及转录后等多水平调控基因的表达，在各类生物学过程和多种类型细胞（包括免疫细胞）的分子信号调控网络中发挥重要作用，[17,18]也为我们明确TAMs极化机制提供了研究思路。目前，snord105b基因在胃癌中的作用并无报道，lncRNA在胃癌微环境TAM中的调控作用并不十分清楚。本研究首先检测了胃癌组织、胃癌患者血清及胃癌细胞系中snord105b的表达水平，评估了其与临床病理参数之间的相关性；通过在胃癌细胞中敲低或过表达snord105b基因，观察胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成、周期和凋亡等生物学特性的改变，了解体外snord105b基因对胃癌细胞生物学功能的影响；通过RNA-ChIRP结合质谱以及western-blot和RIP实验验证实验，探索snord105b基因与ALDOA蛋白相互作用的具体机制；通过裸鼠成瘤实验检测snord105b基因体内对胃癌细胞增殖的影响；利用芯片技术检测M0与M2型巨噬细胞中差异表达的lncRNA，根据lncRNA数据库分析选择NR_109861，检测其在TAMs中的表达水平和极化过程中的作用，及其通过调控胃癌胃环境对胃癌细胞生物学功能的影响。本研究有助于完善非编码RNA-snord105b基因在胃癌进展中作用的认识，以及非编码lncRNA-NR_109861基因在胃癌微环境TAMs中的作用，丰富了胃癌发展的分子理论基础，并为未来胃癌诊断和分子靶向治疗提供新的思路。16 研究论文第一部分Snord105b在胃癌组织、胃癌患者血清和胃癌细胞系中的表达前言SnoRNA又称核仁小RNA，是一种长度介于60-300nt之间，主要位于细胞核仁区的非编码RNA。其中C/DboxsnoRNA与转录后基因调控密切相关，不仅参与核糖体的加工修饰，指导靶核糖残基2′-O-甲基化，并且在选择性mRNA前体剪接过程中发挥重要作用。这些转录后调控对[8]内质网产生高效产物、发挥生物学功能至关重要。Snord105b是一种C/DboxsnoRNA，其宿主基因PPAN参与细胞生长和增殖，并与免疫细胞分[19]化和肿瘤形成相关。然而，snord105b在肿瘤中的作用并无报道。本研究首先运用实时荧光定量PCR技术检测109例胃癌组织及相应癌旁组织、68例胃癌患者血清和25例健康献血者血清，以及多种胃癌细胞系中snord105b基因的表达水平，并分析胃癌组织中snord105b基因的表达水平与胃癌患者临床病理参数的相关性，为研究snord105b基因对胃癌细胞生物学行为的影响奠定基础。材料与方法1实验材料1.1组织标本胃癌组织及相应癌旁正常组织样本均来自河北医科大学第四医院外三科2015-2017年间的手术病人，经病理诊断为胃癌，术前未经放化疗，无其他相关病史。同一患者，取距离胃癌组织≥5cm部位的胃粘膜组织，被认为是相应癌旁正常组织。所有患者均签署者请同意书，所有样本均有详细的临床资料和病理诊断。1.2血清标本胃癌患者血清来自于河北医科大学第四医院外三科2017年间初诊的胃癌患者，正常献血者血清来自于河北医科大学第四医院体检中心健康体17 研究论文检者。1.3细胞株人胃癌细胞系AGS、SGC-7901、BGC-823、MGC-803、HGC-27均来自于河北医科大学第四医院科研中心，人胃粘膜正常永生化细胞GES-1由北京市肿瘤防治研究所遗传室建立并惠赠。1.4主要仪器设备二氧化碳培养箱（TC2323型）德国Heraeus公司光学显微镜（BX41型）日本OLYMPUS公司倒置相差显微镜（TS100型）日本Nikon公司生物安全柜美国Thermo公司全自动高压蒸汽消毒器日本SANYO公司电热恒温干燥箱（202-3AB型）天津市泰斯特仪器有限公司电子分析天平（JA5003）上海精科天平厂电磁搅拌器（7901型）上海华光仪器仪表厂制冰机日本SANYO公司数显三用恒温水箱（HH-W600型）金坛市医疗器械厂台式离心机（B40型）安新县白洋离心机厂低温高速离心机（TTICH-400型）德国Heraeus公司-80℃超低温冰箱日本SANYO公司微量移液器法国Gilson公司微量核酸蛋白检测仪美国Thermo公司微波炉（ZD-11b）上海中达医学应用研究所PCR仪（ABI7500型）美国ABI公司PCR扩增仪（PE9600）美国ABI公司水平电泳仪（DYY-6C）北京六一仪器厂凝胶成像系统（G:box）英国Syngene公司无菌培养瓶无锡耐思生物有限公司无菌培养板无锡耐思生物有限公司1.5主要试剂RPMI1640美国GIBCO/BRL公司DMEM培养液美国GIBCO/BRL公司18 研究论文PBS液参照《细胞培养》配制青链霉素混合液（100×）北京索莱宝科技有限公司胎牛血清美国BI公司胰蛋白酶美国GIBCO公司二甲基亚砜（DMSO）北京北化精细化学品公司Trizol试剂日本Takara公司氯仿北京化学试剂厂异丙醇北京化学试剂厂无水乙醇北京化学试剂厂DEPC水美国Thermo公司反转录试剂盒美国Promega公司PCR引物上海生工技术有限公司DNALadder北京索莱宝科技有限公司琼脂糖美国Promega公司溴化乙锭（EB）美国Sigma公司GoTaq®GreenMasterMix美国Promega公司GoTaq®qPCRMasterMix美国Promega公司2实验方法2.1细胞培养人胃癌细胞均培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中（含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素），于37℃、5%CO2条件下培养。每1-2d换液一次，以0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代，每日于倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，取对数生长期的细胞用于实验。2.2胃癌组织、胃癌患者血清和胃癌细胞总RNA提取并鉴定2.2.1RNA的提取所用实验物品均经0.1%DEPC水浸泡处理，并高压灭菌。具体方法如下：1）实验前准备：制冰，离心机预冷20min；2）组织、血清和细胞的处理：每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪成3mm×3mm左右的小块后放入研磨器中，加入1mlTrizol裂解液，在低温条件下，使用电动组织研磨器将组织充分研磨。随后，将组织19 研究论文匀浆液转移到预冷的1.5mlEP管中。若为血清样本，则取200-300μl血清至1.5mlEP管中，加入800μlTrizol裂解液，冰上裂解10min，使其充分裂解。若为细胞，则取对数生长期的胃癌细胞，弃去培养基，PBS冲洗2遍。向培养瓶中加入1mlTrizol裂解液，冰上静置10min，使其充分裂解，反复吹打后转移至1.5mlEP管中；3）RNA萃取：向EP管中加入200μl氯仿，剧烈震荡12s（手动），冰上静置5min，在4℃条件下，以12000rpm离心15min；4）RNA沉淀：小心吸取上层无色液相加入新的EP管中（不要吸取中间界面，宁少勿多，一般500μl即可），再加入500μl异丙醇，轻柔颠倒混匀，冰上静置10min。在4℃条件下，以12000rpm离心10min；5）RNA洗涤：弃去上清，可见RNA沉于管底。向EP管中加入1ml75%乙醇，温和颠倒EP管，将RNA重新悬浮起来。在4℃条件下，以12000rpm离心5min；6）RNA收获：弃上清，用枪头将剩余的少量乙醇吸干净，室温晾干。将RNA沉淀溶于10-20μlDEPC水中，-80℃保存。2.2.2RNA浓度和纯度的检测微量核酸蛋白检测仪用0.1%DEPC水调零后，取1-2μlRNA稀释液进行浓度及纯度的测定。当1.80.05），而与患者年龄、肿瘤大小、分化程度以及TNM分期呈正相关（P<0.05）（Table1）。2.胃癌患者血清中snord105b基因的表达水平选取25例正常人血清标本和68例未经放化疗的胃癌患者血清标本，运用RT-qPCR检测snord105b基因的表达水平。结果显示：与正常人血清标本（2.0±1.66）相比，胃癌患者血清snord105b的表达水平明显升高（3.8±3.2），差异具有统计学意义（P<0.05）（Fig.2）。3.胃癌细胞系中snord105b基因的表达水平用RT-PCR和RT-qPCR法分别检测胃癌细胞系AGS、SGC-7901、MGC-803、BGC-823、HGC-27和正常胃粘膜永生化细胞GES-1中snord105b基因的表达水平。结果显示五种胃癌细胞中snord105b基因的表达水平分别是：AGS（1.43±0.33）、SGC-7901（1.43±0.08）、MGC-803（1.48±0.41）、BGC-823（1.47±0.49）和HGC-27（1.77±0.48），与正常胃粘膜永生化细胞GES-1中snord105b基因的表达水平相比有不同程度升高，结果具有统计学意义（P<0.05）（Fig.3A-3B）。选取其中的AGS和SGC-7901细胞系进行后续的功能实验。23 研究论文附图图1Snord105b在胃癌组织及相应癌旁正常组织的表达水平Fig.1Snord105bwasupregulatedinGCtissues.(A)Theexpressionofsnord105binGCsamplesandnon-cancertissueswasanalyzedbyqRT-PCR(n=109,*P<0.05).Snord105bexpressionlevelswerenormalizedtoU6.(B)Lowandhighexpressionofsnord105binGCtissuesandnon-cancertissueswasanalyzedbasedonthedataabove.P<0.052015105(NormalizedtoU6)0Non-cancerCancerTheserumsofGCpatients(N=68)Relativesnord105bexpressionlevelandhealthydonors(N=25)图2snord105b在胃癌患者及正常献血者血清中的表达水平Fig.2Snord105bwasupregulatedinGCserum.Snord105bexpressionwasanalyzedbyqRT-PCRintheseraofGCpatientsandcomparedwiththatofthehealthydonors(n=68,*P<0.05).24 研究论文图3snord105b在胃癌细胞系中的表达水平Fig.3Snord105bwasupregulatedinGCcelllines.(A-B)qRT-PCRandRT-PCRanalysisshowedthattheexpressionofsnord105bwashigherintheGCcelllinescomparedwiththenormalgastricimmortalizedepithelialcelllineGES-1(*P<0.05).25 研究论文附表表1胃癌组织中snord105b的表达水平与患者临床病理参数之间的相关性分析Table1Analysisofcorrelationbetweensnord105bandclinicalfeaturesExpressionlevelofParametersTotalsnord105bP-valueLowHighAge/year<604315280.004*≥6066858GenderMale9221710.877Female17314Tumorsize≤56619470.035*>543538DifferentiationWell4916330.015*Poor60852StageⅠ-Ⅱ218130.014*Ⅲ881177Cancerthrombusyes528440.162no5715422χ-testswereused.*Thevalueshadstatisticallysignificantdifferences(N=109).26 研究论文讨论新的RNA检测技术，如深度测序和基因芯片分析表明，大于50%的人类基因组被转录为RNA，而只有小于2％的基因编码蛋白质。因此，非蛋白质编码RNA是基因表达最丰富的形式。非编码RNA是近年来被发现的一类能转录但不编码蛋白质且具有特定功能的RNA小分子，其主要包括lncRNA、miRNA、snoRNA、circRNA等。非编码RNA可参与基因转录和翻译水平的调节、蛋白质的运输、RNA的加工和修饰以及影响染[20-22]色体的结构等。SnoRNAs位于细胞核内，它可以引导核糖体RNA的加工修饰，对蛋白质的合成具有调控作用，所以考虑其可能在肿瘤中具有独特的功能。许多研究通过对比肿瘤组织和其相应的正常组织中snoRNA的表达水平，筛选出差异表达的snoRNA，这提示snoRNA在肿瘤发生发展中作为原癌基因或抑癌基因可能发挥着至关重要的作用，例如snoRNAU50作为肿瘤抑[23,24]制基因参与乳腺癌和前列腺癌的发生，SNORA42作为癌基因参与非[25]小细胞肺癌的进展等。Snord105b是C/DboxsnoRNA家族的成员，其宿主基因PPAN参与免疫细胞的分化和肿瘤的发生过程。但目前对于snord105b基因的作用尚认识不清楚。本研究利用RT-qPCR技术检测了109例胃癌组织及其对应的正常胃粘膜组织中snord105b的表达情况，结果发现与正常胃粘膜组织相比，有85例胃癌组织中snord105b基因表达水平升高，24例表达下降，升高的组织占总数的百分比为77.98%，升高倍数为（2.16±1.69）倍。接下来，我们采用RT-qPCR检测了68例未经放化疗的胃癌患者血清中snord105b的表达水平，结果发现，与25例正常人血清相比，胃癌患者血清中snord105b表达升高，结果具有统计学意义。这提示snoRNA可作为胃癌早期诊断的潜在标志物。随后，本研究利用RT-PCR和RT-qPCR检测了5种胃癌细胞系和正常胃粘膜永生化细胞中snord105b基因表达水平，结果发现，与正常胃粘膜永生化细胞GES-1相比，胃癌细胞系中snord105b基因表达水平有不同程度升高。此外，我们将胃癌组织中snord105b的表达水平与患者的临床病理参数进行了统计分析，结果表明，snord105b的表达水平与患者年龄、胃癌大小、分化程度和肿瘤分期密切27 研究论文相关。基于以上结果，我们推测snord105b基因可能在胃癌的发生发展中起到重要的作用。小结与相应正常胃粘膜组织、健康献血者血清和正常胃粘膜永生化细胞系GES-1相比，胃癌组织、胃癌患者血清和胃癌细胞系中snord105b基因的表达水平明显升高。胃癌组织中snord105b基因表达水平与患者年龄、肿瘤大小、分化程度和TNM分期密切相关。提示，snord105b基因在胃癌的发生发展中可能起到重要作用。参考文献1.NieY,WuK,YuJ,etal.Aglobalburdenofgastriccancer:themajorimpactofChina[J].ExpertRevGastroenterolHepatol,2017,11(7):651-661.2.SanoT.Gastriccancer:Asiaandtheworld.[J].GastricCancer,2017,20(1):1-2.3.AndersonWF,CamargoMC,FraumeniJF,etal.Age-SpecificTrendsinIncidenceofNoncardiaGastricCancerinUSAdults[J].Jama-JAmMedAssoc,2010,303(17):1723-1728.4.LinYS,UedaJ,KikuchiS,etal.ComparativeepidemiologyofgastriccancerbetweenJapanandChina[J].WorldJGastroenterol,2011,17(39):4421-4428.5.WangJ,SongYX,WangZN.Non-codingRNAsingastriccancer[J].Gene,2015,560(1):1-8.6.LiPF,ChenSC,XiaT,etal.Non-codingRNAsandgastriccancer[J].WorldJGastroenterol,2014,20(18):5411-5419.7.DuanF,JiangJ,SongC,etal.Functionallongnon-codingRNAsassociatedwithgastriccancersusceptibilityandevaluationoftheepidemiologicalefficacyinacentralChinesepopulation[J].Gene,2018,28 研究论文646(1):227-233.8.WilliamsGT,FarzanehF.AresnoRNAsandsnoRNAhostgenesnewplayersincancer?[J].NatRevCancer,2012,12(2):84-88.9.KissT.SmallnucleolarRNAs:anabundantgroupofnoncodingRNAswithdiversecellularfunctions[J].Cell,2002,109(2):145-148.10.DongZW,ShaoP,DiaoLT,etal.RTL-P:asensitiveapproachfordetectingsitesof2'-O-methylationinRNAmolecules[J].NucleicAcidsRes,2012,40(20):e157.11.OliveiraJVDA,CostaF,BackofenR,etal.SnoReport2.0:newfeaturesandarefinedSupportVectorMachinetoimprovesnoRNAidentification[J].BmcBioinformatics,2016,17(18):464.12.RutkowskiMR,SvoronosN,Perales-PuchaltA,etal.TheTumorMacroenvironment:Cancer-PromotingNetworksBeyondTumorBeds[J].AdvCancerRes,2015,128(1):235-262.13.GuoQ,JinZ,YuanY,etal.NewMechanismsofTumor-AssociatedMacrophagesonPromotingTumorProgression:RecentResearchAdvancesandPotentialTargetsforTumorImmunotherapy[J].JImmunolRes,2016,2016(1):9720912.14.SolinasG,GermanoG,MantovaniA,etal.Tumor-associatedmacrophages(TAM)asmajorplayersofthecancer-relatedinflammation[J].JLeukocBiol,2009,86(5):1065-1073.15.ZarifJC,TaichmanRS,PientaKJ.TAMmacrophagespromotegrowthandmetastasiswithinthecancerecosystem[J].Oncoimmunology,2014,3(7):e941734.16.MantovaniA,SchioppaT,PortaC,etal.Roleoftumor-associatedmacrophagesintumorprogressionandinvasion[J].CancerMetastasisRev,2006,25(3):315-322.17.SchmittAM,ChangH.LongNoncodingRNAsinCancerPathways[J].Cancercell,2016,29(4):452-463.18.FlynnRA,ChangHY.LongNoncodingRNAsinCell-FateProgrammingandReprogramming[J].CellStemCell,2014,14(6):752-761.29 研究论文19.PfisterAS,KeilM,KuhlM.TheWntTargetProteinPeterPanDefinesaNovelp53-independentNucleolarStress-ResponsePathway[J].JBiolChem,2015,290(17):10905-10918.20.FlintoftL.Non-codingRNA:StructureandfunctionforlncRNAs[J].NatRevGenet,2013,14(9):598.21.QuinnJJ,ChangHY.Uniquefeaturesoflongnon-codingRNAbiogenesisandfunction[J].NatRevGenet,2016,17(1):47-62.22.YangY,WenL,ZhuH.Unveilingthehiddenfunctionoflongnon-codingRNAbyidentifyingitsmajorpartner-protein[J].Cell&bioscience,2015,5(1):59.23.DongXY,GuoP,BoydJ,etal.ImplicationofsnoRNAU50inhumanbreastcancer[J].JGenetGenomics,2009,36(8):447-454.24.DongXY,RodriguezC,GuoP,etal.SnoRNAU50isacandidatetumor-suppressorgeneat6q14.3withamutationassociatedwithclinicallysignificantprostatecancer[J].HumMolGenet,2008,17(7):1031-1042.25.MeiYP,LiaoJP,ShenJ,etal.SmallnucleolarRNA42actsasanoncogeneinlungtumorigenesis[J].Oncogene,2012,31(22):2794-2804.30 研究论文第二部分Snord105b基因对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制前言蛋白质是生物体生命功能的执行者，而核糖体在蛋白质合成中发挥重要作用。SnoRNAs主要富集于细胞核内，其主要作用是引导核糖体RNA和其他小RNA的加工修饰，所以snoRNAs的表达变化可能在肿瘤中具有重要作用。近年来，许多研究表明，snoRNAs可作为癌基因或者抑癌基因参与肿瘤的发生发展，例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、非小细胞[1-8]肺癌和白血病等。此外，snoRNAs可以通过多种行为方式影响肿瘤进展，例如肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT途径、周期凋亡、血管生成[9,10]和化疗敏感性等。目前，我们的研究发现，非编码RNA-snord105b在胃癌组织中表达升高，但其如何影响胃癌的生物学功能，我们仍不清楚，需要进一步研究。[11]非编码RNA可通过多种机制促进癌症进展，例如：调控癌基因和抑癌基因启动子区域的转录活性，或者与特定蛋白质相互结合，通过调节蛋白含量、细胞定位及表观遗传学改变而发挥作用等等。例如，lncRNA-[12]HULC通过促进其相互结合蛋白YB-1的磷酸化，影响肝癌进展，lncRNA-CASC9通过招募CREB结合蛋白CBP（CREB-bindingprotein），[13]影响LAMC2基因启动子区的乙酰化水平，从而促进食管癌的转移。因此，寻找与snordRNA相互作用的蛋白，并研究两者相互作用的具体机制，成为snordRNA作用机制研究的重要手段之一。在本研究中，我们首先检测了snord105b对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学特性的影响，接下来采用RNA-ChIRP联合质谱分析方法找到可能与snord105b相互结合的蛋白，并对这些蛋白进行生物信息学分析。通过数据库筛选评分较高的兴趣蛋白，用western-blot和RIP验证进行，最终确定与snord105b特异性结合的蛋白ALDOA，并进一步探讨snord105b如何通过ALDOA蛋白在胃癌中发挥作用的机制。31 研究论文材料与方法1主要试剂与设备1.1Snord105b相关的siRNA、质粒及生物素标记探针Snord105b质粒由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，siRNA由广州市锐博生物科技有限公司设计合成，其序列如下：siRNA序列（5’-3’）snord105bsi-1CTGCTGAGACGCTGTGATTsnord105bsi-2GGCTGATGACAGCACTTCT生物素标记的snord105b探针由广州吉玛生物科技有限公司设计合成，其序列如下：Biotin-probe序列（5’-3’）snord105b-1GTTTACTTTGGACAGAGCAATCsnord105b-2TCAGCAGAAGTGCTGTCATCAGCCGCATGTGGU6-1GCCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTTU6-2TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTG1.2主要仪器设备振荡培养箱（HZQ-X100）哈尔滨东联电子技术有限公司Transwell小室美国Corning公司流式细胞仪（C6）美国BD公司激光共聚焦显微镜（LSM510）德国ZEISS公司酶标仪（2010型）奥地利Anthos公司蛋白质转移电泳槽DYYIII31B北京六一仪器厂Odyssey双色红外荧光成像仪德国LI-COR公司其他仪器同第一部分1.3主要试剂质粒小提试剂盒北京天根生化科技有限公司质粒大提试剂盒北京天根生化科技有限公司LB液体培养基北京索莱宝科技有限公司氨苄青霉素北京索莱宝科技有限公司32 研究论文感受态大肠杆菌（DH5α）北京全式金生物技术有限公司细胞裂解液（RIPA）北京索莱宝科技有限公司苯甲基磺酰氟（PMSF）北京索莱宝科技有限公司碘化丙啶染液（PI）北京索莱宝科技有限公司Annexin/PI染液美国BD公司5×蛋白上样缓冲液北京索莱宝科技有限公司1.5MTris-HCl（pH8.8）北京索莱宝科技有限公司1.0MTris-HCl（pH6.8）北京索莱宝科技有限公司十二烷基硫酸钠（SDS）北京索莱宝科技有限公司过硫酸铵（APS）北京索莱宝科技有限公司30%丙烯酰胺北京索莱宝科技有限公司TEMED美国Sigma公司甘氨酸美国Sigma公司Tris北京索莱宝科技有限公司Tween-20美国Amresco公司甲醇北京化学试剂厂YeasttRNA美国Invitrogen公司BiotinRNAlabelingmix美国Roche公司NTPmix美国Invitrogen公司RibonucleosideVanadylComplex美国NEB公司TMMagnaRIPkit12Reactions美国Milipore公司凝胶快速银染试剂盒上海碧云天生物技术公司兔抗人ALDOA抗体美国Proteintech公司兔抗人C-myc抗体美国CST公司兔抗人MMP2抗体美国Proteintech公司兔抗人E-Cadherin抗体美国Bioworld公司兔抗人Vimentin抗体美国Bioworld公司兔抗人N-Cadherin抗体美国Bioworld公司兔抗人BCL2抗体美国Proteintech公司兔抗人Bax抗体美国Proteintech公司兔抗人cyclinD1抗体美国Proteintech公司33 研究论文兔抗人CDK2抗体美国Proteintech公司兔抗人CDK4抗体美国Proteintech公司兔抗人GAPDH抗体美国Bioworld公司羊抗兔荧光二抗美国ROCKLAND公司其他试剂同第一部分2实验方法2.2重组质粒的扩增与提取2.1.1将质粒DNA转化到感受态大肠杆菌DH5α中：1）转化：将感受态大肠杆菌与质粒在冰上溶解，取质粒0.5-1μg，加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α中，冰上静置30min，42℃金属浴热激90s，冰上静置3~5min；2）大肠杆菌活化：向上述混合物中加入900μlAmp（-）的LB液体培养基，置于37℃震荡培养箱中培养1h，使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；3）铺板：将上述菌液摇匀后离心，弃上清后取少量菌液涂布于Amp（+）的固体LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置于培养箱中，37℃培养16~24h；4）挑菌小摇：16h后，LB固体培养皿中可见有菌落形成，挑取单一菌落放入8mlAmp（+）的LB液体培养基中，37℃震荡培养8h，可见培养基由澄清变浑浊；5）菌种保存及质粒鉴定：留取500μl菌液+500μl甘油保存于-20℃冰箱，其余菌液按TIANGEN质粒小提试剂盒提取质粒，并进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒；6）质粒大摇：取200μl保存的菌种加入到200mLAmp（+）LB液体培养基（Amp终浓度为100ng/ml）中，37℃震荡培养箱中培养过夜。2.1.2质粒提取使用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，按说明书具体步骤如下：1）柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入收集管中）加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（注意：用平衡液处理过的柱子最好立即使用）；34 研究论文2）收集细菌：取100ml过夜培养的菌液，加入干净的离心管中，室温8000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清；3）细菌裂解：向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1（确认事先加入RNaseA），使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮沉淀的细菌；4）向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6~8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。此时菌液变得清亮粘稠；5）向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6~8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀，室温放置10min，8000rpm离心30min，使白色沉淀离至管底，将全部滤液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml离心管中；6）向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）；7）室温8000rpm离心2min，将收集管中的液体重新倒入CP6中，再次室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中；8）向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW（确认事先加入无水乙醇），8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；9）重复操作步骤8；10）向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液；11）将吸附柱重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是除去吸附柱中残余的漂洗液；12）将吸附柱CP6置于超净工作台，放入一个干净的50ml收集管中，将盖子打开，室温放置5-10min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。向吸附膜的中间部位悬空滴加500-800μlddH2O，室温放置5min，然后室温8000rpm离心5min。将洗脱液全部移入一个干净的1.5mlEP管中，测其浓度和纯度，A260/A280≥1.8代表纯度合格，-20℃保存备用。2.2细胞转染取对数生长期的SGC-7901和AGS细胞，铺入六孔板中，待细胞呈70%~80%融合状态时，按Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染，具体步骤如下：35 研究论文1）弃去六孔板中细胞培养基并用PBS将细胞冲洗2遍，加入800μl无血清无双抗的RPMI1640培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中培养1h；2）对于每孔细胞，取100μl无牛清无双抗的RPMI1640培养基加入1.5mlEP管中，向其中加入3μlsnord105b-siRNA/nc-siRNA，或者3μgsnord105b/CD511B质粒，将两者的混合液轻轻吹打混匀，室温静置5min；3）对于每孔细胞，取100μl无牛清无双抗的RPMI1640培养基加入1.5mlEP管中，向其中加入3-4μlLipofectamine2000转染试剂，将两者的混合液轻轻吹打混匀，室温静置5min；4）将步骤2）、3）的溶液混合，轻轻混匀后，室温静置20min，使复合物形成；5）将步骤4）中的复合物加到六孔板中，轻轻混匀，37℃，5%CO2培养箱中培养4-6h；6）6h后将无牛清无双抗培基换成含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5%CO2培养箱中继续培养，根据实验内容，于不同时间点收集细胞。2.3MTS法检测snord105b基因对胃癌细胞增殖活性的影响1）分组：过表达组分为CD511B质粒转染组和snord105b质粒转染组，敲低组分为si-nc组和si-snord105b转染组；2）铺板：取对数生长期的SGC-7901和AGS细胞分别进行转染，24h后将上述各组细胞消化并悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，5调整细胞浓度为1×10个/ml，分别接种于96孔培养板中，每组设6个复3孔，每孔接种2×10个细胞，补齐培基至100μl；3）检测：于贴壁后0、24、48、72、96h后，每孔细胞中加500μg/mlMTS试剂20μl，37℃孵育2h后，用全自动定量酶标仪在波长492nm处测定吸光度，结果取6个复孔的平均值，该实验重复3次。2.4Transwell小室检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响51）细胞计数，调整细胞浓度：向上室中加入1×10个细胞，并用无牛清无双抗RPM1640培养基补齐200μl，下室内加入600μl含20%FBS的RPM1640培养基；2）细胞迁移：将小室放入37℃，5%CO2培养箱中，迁移16-20h后，36 研究论文弃去滤膜上、下室的培养液，用PBS清洗三遍；3）细胞固定：在下室中加入4%多聚甲醛600μl，放入小室，使滤膜下表面细胞浸入其中，固定10min；4）晾干：弃去固定液，倒置小室，使滤膜下表面朝上，自然风干；5）染色：在下室中加入600μl结晶紫染液，将风干后的小室滤膜下表面浸入染液，染色10min；6）观察计数：蒸馏水清洗染液，用棉签轻轻拭去小室上表面未迁移的细胞，在倒置显微镜下随机观察5个视野（×200），并计数穿膜细胞。对于细胞侵袭实验，则应提前一天在小室上表面铺入Matrigel基质胶：将4ºC过夜溶解的Matrigel胶用无血清的培养基按1:3的比例稀释，使Matrigel胶的终浓度为1mg/ml。该操作需在冰上进行，避免Matrigel胶在常温下出现不可逆性凝固。将Transwell小室置于无菌的24孔板中，向小室中加入20μl稀释好的Matrigel胶，快速晃动24孔板，使其均匀铺满上室底面。将铺好Matrigel胶的24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中，第二天步骤同细胞迁移实验。2.5划痕愈合实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞迁移能力的影响1）按照实验要求对SGC-7901和AGS细胞进行转染；52）准备六孔板，每孔加入2ml培基，以及5×10个细胞（具体数量因细胞种类不同而异，接种原则为过夜后细胞融合率达到100%）。每实验组设3个复孔；3）第二天，用同一枪头比着直尺，在相同的角度和力度下，对细胞进行划线，每孔三条直线；4）用PBS洗涤2遍，去除多余的游离细胞，加入含有1%FBS的RPMI1640培养基，并用相差显微镜对划痕进行标记和拍照；5）继续培养24h或者48h后，再对划痕进行拍照。对比前后两次划痕宽度变化，即绝对迁移距离，用对照组数据进行标准化，即得到各组细胞的相对迁移能力。2.6克隆形成实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞克隆形成能力的影响1）按照实验要求对SGC-7901和AGS细胞进行转染；37 研究论文2）准备六孔板，每孔加入2ml培基，以及1500个细胞，每实验组设3个复孔；3）细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养10-14d，观察其克隆形成情况；4）当细胞形成肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养基，用PBS小心清洗细胞2次，每孔加入1ml4%甲醛固定10min。弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净；5）在培养孔中加入1ml结晶紫染液染色3-5min。以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥，照相并计算克隆数。2.7流式细胞技术检测敲低snord105b基因对胃癌细胞周期和凋亡的影响2.7.1细胞周期的检测采用PI染色对细胞周期的变化进行检测，操作步骤如下：61）小心吸除细胞培养液，用胰酶消化细胞，调整细胞浓度为1×10个/ml，取1ml单细胞悬液进行后续操作；2）1000rpm离心5min，沉淀细胞，加入1ml预冷的PBS，离心洗涤细胞，去除上清，可残留约50μl左右的PBS。轻弹离心管以适当分散细胞，避免细胞成团；3）细胞固定：用预冷的75%乙醇4°C固定1h至过夜。固定时，缓慢滴加75%乙醇，以防直接加入导致细胞团聚的现象；4）第二天，去除固定液：离心沉淀细胞，小心吸除上清，用冷PBS离心洗涤细胞。重复洗涤以除去固定液，残留约50μl的PBS，轻轻弹击离心管以适当分散细胞，避免细胞成团；5）加入500μl的PI染液，轻轻混匀后4ºC避光孵育30min；6）用流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处红色荧光，进行分析。2.7.2细胞凋亡的检测1）小心吸除细胞培养液，用冷PBS缓冲液洗涤细胞2次，用1×Binding6Buffer调整细胞浓度为1×10个/ml；52）取100μl细胞悬液（约1×10个细胞）置于5ml流式细胞试管中；3）向各实验管中分别加入5μlAnnexinV和5μlPI试剂；4）轻轻混匀，室温避光反应15min；5）向各试验管中分别加入400μl1×BindingBuffer缓冲液，混匀；6）1h内上流式细胞仪检测。38 研究论文2.8RNA-ChIRP实验2.8.1细胞预处理及核蛋白提取首先进行细胞预处理：将SGC-7901细胞用冷PBS洗涤2次，用1%甲醛在37℃、5%CO2培养箱中固定10min，使RNA和蛋白发生交联，最后用0.1-0.2M的甘氨酸缓冲液室温平衡5min，再用冷PBS洗涤3次。随后，使用Thermo的NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionReagents试剂盒提取细胞核蛋白，具体步骤如下：1）用细胞刮子将培养皿内SGC-7901细胞刮下来，500g离心5min；收集细胞于1.5ml的EP管中，用移液器尽可能将上清去除干净；2）加入100μl事先处理好的冷的CERI，在漩涡振荡器上以最大速度振荡15s，冰上静置10min；3）加入5.5μl预冷的CERII，在漩涡振荡器上以最大速度振荡5s，冰上静置1min；4）在漩涡振荡器上以最大速度振荡5s，4℃以12000rpm离心5min；5）取上清迅速转移到一个干净的EP管中，此为胞浆蛋白，-80℃冻存；6）向剩余沉淀物中加入120μl预冷的NER，同时加入RNA酶抑制剂和蛋白酶抑制剂；7）在漩涡振荡器上以最大速度振荡15s，冰上静置10min；继续振荡15s，冰上静置10min，以此重复4次；8）4℃以12000rpm离心10min；9）将上清迅速转移到新的EP管中，此为胞核蛋白，-80℃冻存。2.8.2ChIRP实验注意：本实验所有试剂均用DEPC水配制，所有实验用品均为DEPC水处理后使用。1）RNAbindingbuffer：50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2，10mmol/LHEPES(pH7.5），0.5%NP40；注意：RNAbindingbuffer使用前还应加入：2mmol/LDTT，1mmol/LEDTA，100U/mlRNaseInhibitor(40U/μl），400μmol/LVRC(Vanadyribonucleosidecomplexes200mmol/L母液），20μL/mlProteaseInhibitor（4种），100μg/mltRNA，混匀后即为RNAworkingbuffer。39 研究论文2）StreptavidinSepharose珠子处理：取400μl珠子，加入RNAbindingbuffer洗3遍，去上清，加入600μlRNAworkingbuffer重悬珠子，4℃放置备用；3）探针和蛋白结合：取100-300μl蛋白裂解液，加500-700μlRNAworkingbuffer和1-2μg探针，混匀，30℃水浴30min，形成RNA-蛋白复合体；4）结合珠子：将RNA-蛋白复合物中加入处理好的StreptavidinSepharose珠子，室温颠倒混合50min；5）4℃，1500rpm离心3min，去上清，每次加入1mlRNAworkingbuffer洗涤6遍；6）离心去上清，珠子中加入30μlPBS和20μL5×蛋白loadingbuffer，转至1.5mlEP管中，98℃变性8min；7）-20℃保存或直接SDS-PAGE，银染或者用相应抗体检测探针拉下来的蛋白。选择特异条带进行质谱实验或者进行免疫杂交。2.8.3SDS-PAGE快速银染，按说明书进行操作，步骤如下：1）固定：电泳结束后，先将凝胶用ddH2O冲洗5min，去掉表面蛋白，将凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景；2）30%乙醇洗涤：弃去固定液，加入100ml30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm；3）水洗涤：弃30%乙醇，加入200mlMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm；4）增敏：弃水，加入100ml银染增敏液（1X），在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm；5）水洗涤（共2次）弃原有溶液，加入200mlMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm，弃水，再加入200mlMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm；6）银染：弃水，加入100ml银溶液（1X），在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm；7）水洗涤：弃银溶液，加入100mlMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm，注意：水洗涤的时间不能40 研究论文超过1.5分钟；8）显色：弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，摇动速度为60-70rpm。密切关注凝胶条带显色，直至出现比较理想的预期蛋白条带，及时终止，以防染色背景过深；9）终止：弃银染显色液，加入100ml银染终止液（1×），在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm，终止时有气体产生，气体为二氧化碳，属正常；10）水洗涤：弃银染终止液，加入100mlMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm；11）保存：可在MilliQ级纯水或者双蒸水中保存。或者用适当的方法制成干胶保存。注意：本部分实验所用试剂全部使用MilliQ级纯水或双蒸水配制。2.9Westernblot方法检测蛋白表达2.9.1总蛋白的提取1）实验前准备：制冰、离心机预冷；2）转染的各组细胞用预冷的PBS溶液轻轻洗两遍，用细胞刮子刮下细胞，收集到1.5ml的EP管中；3）4℃，8000rpm离心5min，弃去上清液；4）配制细胞裂解液：按RIPA:PMSF=100:1配制裂解液，混匀，冰上静置5min；5）加入细胞裂解液，反复吹打混匀，冰上静置20-30min，每隔10min用漩涡振荡器振荡10s，重复2-3次；6）4℃，12000rpm离心30min，收集上清液即为细胞总蛋白，-80℃保存。2.9.2总蛋白定量1）根据样本数量，BCA试剂中A液和B液按50:1配制适量的BCA工作液，充分混匀，4℃保存；2）完全溶解5mg/mL的蛋白标准品（BSA），取14μl蛋白标准品，用PBS缓冲液稀释至70μl，配制终浓度为1mg/mL的标准蛋白工作液；3）将稀释的蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl分别加入到96孔板的标准品孔内，加PBS缓冲液补足至20μl；41 研究论文4）加1μl蛋白样品到96孔板的样品孔内，加PBS缓冲液补足至20μl；5）每孔分别加入200μlBCA工作液，摇床上混匀5-10min后，37℃孵育30min；6）用酶标仪测定波长为572nm时的吸光度值，根据标准曲线计算蛋白样品的浓度。2.9.3蛋白变性准确测定蛋白样品的体积，将蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液以4:1比例混匀，煮沸5min变性，冷却至室温，-20℃保存。2.9.4Western-blot过程1）配制SDS-PAGE凝胶，如下表：10%12%5%分离胶浓缩胶(μl)(μl)(μl)双蒸水4.03.3双蒸水3.430%丙烯酰胺3.34.030%丙烯酰胺0.831.5MTris-HCl(pH8.8)2.52.51.0MTris-HCl(pH6.8)0.6310%SDS0.10.110%SDS0.0510%APS0.10.110%APS0.05TEMED0.0040.005TEMED0.0052）将变性后的蛋白质，按浓度分别加入浓缩胶的上样孔中；取4μl蛋白marker加于上样孔；3）4℃条件下，恒压80V，在电泳缓冲液中泳动2-3h，根据蛋白分子量不同进行分离；4）根据目的蛋白大小将分离的蛋白区带凝胶切下，置于转膜缓冲液中浸泡，PVDF膜先在甲醇中浸泡3min使其激活，再放入转膜缓冲液中平衡5min；5）将PVDF膜平铺在凝胶上，PVDF膜和凝胶两侧各放三层滤纸，凝胶在负极，PVDF膜在正极，放入电转仪中，4℃条件下进行印记电泳（300mA，1.5h）；6）取出PVDF膜，用5%脱脂奶粉37℃封闭1h；7）TBST洗膜10min×3次，加入TBST稀释的相应的一抗，4℃孵育42 研究论文过夜；8）第二天，TBST洗膜10min×3次，加入TBST稀释的红外荧光标记的二抗，避光条件下37℃反应1h；9）在避光条件下，TBST洗膜10min×3次，用Odyssey双色红外荧光扫描系统进行成像并分析。2.10细胞免疫荧光实验1）按实验要求，对SGC-7901和AGS细胞进行基因质粒转染；2）转染24h后，将细胞消化并铺于激光共聚焦小皿中，使细胞稳定贴壁；3）PBS清洗细胞，用4%甲醛固定20min；4）0.01MPBS洗三次，5min/次；5）用含10%BSA的封闭液于37℃孵育30min；6）加入2%BSA稀释的特异性一抗（兔抗ALDOA一抗，1:200稀释），湿盒中4℃孵育过夜；7）第二天，用含0.1%Tween20的PBST洗涤细胞5min×3次；8）加入2%BSA稀释的二抗--FITC标记的山羊抗兔IgG（SantaCruze），湿盒中避光室温孵育1h，用含0.1%Tween20的PBST洗涤细胞5min×3次；9）加入DAPI试剂染细胞核，湿盒中室温避光孵育10min，用含0.1%Tween20的PBST洗涤细胞5min×3次；10）荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察结果，采集图像。2.11统计学处理所有数据使用SPSS21.0软件统计分析。计量资料用（XS）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。43 研究论文结果1.建立敲低或过表达snord105b基因的胃癌细胞株在胃癌细胞SGC-7901和AGS中分别转染snord105bsi-1、snord105bsi-2、snord105bsi-nc或者snord105b质粒、CD511B空质粒，通过实时荧光定量PCR法验证转染效率，结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1和si-2转染组snord105b基因的相对表达水平分别为（0.45±0.07）、（0.62±0.08），与对照si-nc组相比表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组的表达水平为（2.04±0.51），与CD511B空质粒转染组相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，snord105bsi-1和si-2转染组snord105b基因的相对表达水平分别为（0.63±0.06）、（0.47±0.3），与对照si-nc组相比表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组snord105b基因的相对表达水平为（3.92±1.11），与CD511B空质粒转染组相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.1A-1B）。以上结果提示，在胃癌细胞系SGC-7901和AGS中成功敲低或者过表达snord105b基因。2.Snord105b基因表达对胃癌细胞系体外增殖活性的影响采用MTS方法检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞系SGC-7901和AGS体外增殖活性的影响。将各组细胞分别接种于96孔板后，在0h、24h、48h、72h、96h五个时间点，用酶标仪测定波长492nm处各组细胞的吸光度值。结果显示，SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组五个时间点的OD值分别为（0.17±0.01）、（0.46±0.04）、（0.55±0.05）、（0.65±0，04）、（0.75±0.06），snord105bsi-2转染组五个时间点的OD值分别为（0.18±0.01）、（0.48±0.06）、（0.57±0.01）、（0.69±0.11）、（0.86±0.03），与snord105bsi-nc转染组五个时间点的OD值（0.18±0.01）、（0.51±0.02）、（0.65±0.03）、（0.88±0.03）、（1.12±0.05）相比，在72h和96h两个时间点OD值明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组五个时间点的OD值分别为（0.19±0.01）、（0.54±0.01）、（0.64±0.03）、（0.89±0.04）、（1.09±0.07），与CD511B空质粒转染组OD值（0.19±0.01）、（0.47±0.03）、（0.56±0.04）、（0.81±0.05）、（0.9±0.07）相比，在72h和96h两个时间点OD值明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细44 研究论文胞中，snord105bsi-1转染组五个时间点的OD值分别为（0.18±0.01）、（0.36±0.06）、（0.48±0.07）、（0.61±0.06）、（0.83±0.09），snord105bsi-2转染组五个时间点的OD值分别为（0.18±0.02）、（0.38±0.03）、（0.54±0.02）、（0.68±0.04）、（0.94±0.08），与snord105bsi-nc转染组的OD值（0.18±0.01）、（0.43±0.07）、（0.66±0.06）、（0.84±0.07）、（1.18±0.03）相比，在72h和96h两个时间点OD值明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Snord105b质粒转染组五个时间点OD值分别为（0.16±0.01）、（0.39±0.04）、（0.54±0.04）、（0.78±0.07）、（0.89±0.04），与CD511B空质粒转染组（0.16±0.01）、（0.36±0.05）、（0.48±0.01）、（0.66±0.05）、（0.78±0.09）相比，在72h和96h两个时间点OD值明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.2A-2B）。这些结果提示，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低snord105b可抑制其体外增殖活性，而过表达snord105b可促进这两种胃癌细胞的体外增殖活性。3.Snrd105b对胃癌细胞系体外迁移能力的影响首先采用Transwell实验检测snord105b对胃癌细胞SGC-7901和AGS在体外迁移能力的影响。让小室中细胞迁移16-20h后取出小室，固定染色，在倒置显微镜下观察穿过小室基底膜的细胞数量。结果显示：在SGC-7901细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（22.15±2.83），snord105bsi-2转染组为（31.56±3.54），与snord105bsi-nc转染组（62.5±7.54）相比明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组每个高倍视野的细胞平均数是（61.12±2.83），与CD511B空质粒转染组（26.59±8.43）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（16.16±1.41），snord105bsi-2转染组为（24.57±3.89），与snord105bsi-nc转染组（50.56±3.54）相比明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组每个高倍视野的细胞平均数是（40.15±5.34），与CD511B空质粒转染组（20.94±4.65）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.3A-3B）。其次，我们用划痕愈合实验检测了snord105b基因表达变化对胃癌细胞SGC-7901和AGS在体外迁移能力的影响。结果显示，在SGC-7901细胞中，24h和48h划痕愈合率分别为snord105bsi-1转染组（66.52±2.12）%、45 研究论文（76.12±1.41）%，snord105bsi-2转染组（68.72±1.69）%、（78.52±2.12）%，与snord105bsi-nc转染组（76.82±4.12）%、（89.92±1.63）%相比划痕愈合能力减慢，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组24h和48h的划痕愈合率分别是（77.62±2.34）%、（93.25±1.67）%，与CD511B空载体组（470.56±2.12）%、（78.26±2.83）%相比划痕愈合能力增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，24h和48h划痕愈合率分别为snord105bsi-1转染组（66.52±2.12）%、（76.45±1.45）%，snord105bsi-2转染组（70.12±1.67）%、（78.59±2.45）%，与snord105bsi-nc转染组（80.13±1.47）%、（90.02±4.65）%相比划痕愈合能力减慢，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组24h和48h的划痕愈合率分别是（77.12±1.54）%、（90.89±3.45）%，与CD511B空载体组（70.56±2.12）%、（78.23±2.83）%相比划痕愈合能力增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.3C-3F）。以上实验说明，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低snord105b基因可抑制其体外迁移能力，而过表达snord105b基因可促进这两种胃癌细胞的体外迁移能力。4.Snord105b基因表达改变对胃癌细胞系体外侵袭功能的影响采用Matrigel基质胶侵袭实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞SGC-7901和AGS在体外侵袭能力的影响。将小室中细胞培养20-24h后取出小室，固定染色，在倒置显微镜下观察穿过小室基底膜的细胞数量。结果显示：在SGC-7901细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（22.89±4.24），snord105bsi-2转染组为（26.58±3.54），与snord105bsi-nc转染组（48.56±5.66）相比明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组每个高倍视野的细胞平均数是（50.34±2.83），与CD511B空质粒转染组（23.56±3.34）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（30.56±2.12），snord105bsi-2转染组为（39.54±3.54），与snord105bsi-nc转染组（68.5±4.95）相比明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组每个高倍视野的细胞平均数是（67.52±6.36），与CD511B空质粒转染组（36.57±3.54）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.4A-4B）。5.Snord105b基因表达变化对胃癌细胞系体外克隆形成能力的影响46 研究论文利用克隆形成实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞SGC-7901和AGS在体外克隆形成能力的影响。六孔板中细胞培养10-14d，形成肉眼可见克隆，经固定染色，计数形成克隆的数量，实验设立三个副孔，并重复三次。结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组、snord105bsi-2转染组的克隆平均数分别为（41.9±5.66）、（49.5±3.54），与snord105bsi-nc转染组（79.6±7.07）相比明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组的克隆平均数是（89.5±9.19），与CD511B空质粒转染组（52.2±7.07）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组、snord105bsi-2转染组的克隆平均数分别为（48.3±8.49）、（61.54±7.78），与snord105bsi-nc转染组（90.2±6.36）相比明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组的克隆平均数是（98.7±12.73），与CD511B空质粒转染组（59.5±3.54）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.5A-5B）。根据上述结果说明，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低snord105b基因降低其克隆形成能力，而过表达snord105b基因促进这两种胃癌的克隆形成能力。6.敲低snord105b基因对胃癌细胞周期分布的影响流式细胞技术检测snord105基因分对胃癌细胞周期分布的影响。结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组、snord105bsi-2转染组细胞的G0/G1期所占比例分别为60.4%、57.6%，与snord105bsi-nc转染组51.2%相比明显增加，且si-1、si-2转染组细胞S期所占比例分别为24.2%、26.4%，与si-nc组34.6%相比明显降低；在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组、snord105bsi-2转染组细胞的G0/G1期所占比例分别为42.2%、40.3%与snord105bsi-nc转染组35.4%相比明显增加，且si-1、si-2转染组细胞S期所占比例分别为27.6%、33.2%，与si-nc转染组39.3%相比明显降低（Fig.6A-6D）。上述结果表明，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低snord105b基因导致细胞周期G0/G1期比例明显增加，S期细胞比例明显下降。提示，敲低snord105b基因可使胃癌细胞周期阻滞在G0/G1期，相应地降低了S期的百分比。7.敲低snord105b基因表达对胃癌细胞早期凋亡的影响47 研究论文流式细胞技术检测敲低snord105b基因表达对胃癌细胞早期凋亡的影响。结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组和si-2转染组的细胞凋亡率分别是（5.05±0.92）、（3.7±0.28），与si-nc转染组（1.2±0.16）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组和si-2转染组的细胞凋亡率分别是（6.5±0.85）、（3.8±0.57），与si-nc转染组（1.6±0.42）相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.7A-7D）。这些结果提示，敲低snord105b基因表达可促进胃癌细胞的早期凋亡。8.Snord105b基因表达变化对胃癌细胞增殖、周期和凋亡相关蛋白表达的影响Western-blot检测结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2和BAX蛋白相对表达量分别为（0.22±0.03）、（0.37±0.03）、（0.24±0.05）、（0.45±0.07）、（0.57±0.1），snord105bsi-2转染组五种蛋白的相对表达水平分别为（0.29±0.13）、（0.52±0.1）、（0.36±0.06）、（0.46±0.04）、（0.44±0.05），与snord105bsi-nc转染组五种蛋白的表达水平（0.59±0.04）、（0.76±0.06）、（0.56±0.08）、（0.61±0.03）、（0.33±0.05）相比，MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2蛋白表达水平降低，而BAX蛋白的表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2和BAX蛋白相对表达水平分别为（0.97±0.1）、（0.98±0.25）、（0.86±0.09）、（0.71±0.09）、（0.26±0.06），与CD511B空质粒转染组五种蛋白的表达水平（0.65±0.07）、（0.74±0.06）、（0.60±0.09）、（0.59±0.05）、（0.39±0.12）相比，MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2蛋白表达升高，BAX蛋白的表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2和BAX蛋白相对表达水平量分别为（0.35±0.07）、（0.68±0.16）、（0.42±0.11）、（0.78±0.11）、（1.09±0.12），snord105bsi-2转染组五种蛋白的相对表达水平分别为（0.51±0.03）、（0.76±0.06）、（0.66±0.06）、（1.13±0.12）、（0.95±0.08），与snord105bsi-nc转染组五种蛋白的相对表达水平（0.76±0.09）、（1.03±0.02）、（0.93±0.10）、（1.36±0.22）、（0.58±0.02）相比，MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2蛋白表达下调，BAX蛋白的表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染48 研究论文组MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2和BAX蛋白相对表达水平为（0.91±0.13）、（1.17±0.10）、（1.07±0.04）、（1.6±0.14）、（0.39±0.06），与CD511B空质粒转染组五种蛋白的相对表达水平（0.75±0.05）、（0.97±0.05）、（0.86±0.15）、（1.36±0.10）、（0.56±0.06）相比，MMP2、CyclinD1、CDK4、Bcl-2蛋白表达升高，BAX蛋白的表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.8A-8D）。以上结果提示，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低snord105b基因促进促凋亡蛋白BAX的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4以及细胞侵袭蛋白MMP2的表达水平；而过表达snord105b抑制促凋亡蛋白BAX的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4以及细胞侵袭蛋白MMP2的表达水平。9.ChIRP实验联合质谱分析鉴定snord105b基因的结合蛋白以上实验对snord105b基因在体外胃癌细胞中的功能进行研究，并检测了下游功能蛋白的表达，证明其与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成及周期凋亡相关。那么它是通过哪些机制发挥作用的呢？探索snord105b基因与蛋白质的相互结合可能是其发挥作用的重要机制之一，因此采用生物素标记RNA-ChIRP技术联合质谱分析鉴定snord105b基因的结合蛋白。结果显示，snord105b正义链探针组（sense）与对照组：全蛋白组（input）和snord105b反义链组（antisense）相比，得到一条snord105b正义链探针组所拉下的特异性结合蛋白条带（Fig.9A）。将这个条带切胶酶解，进行质谱分析，鉴定出286种可能与snord105b基因相互结合的蛋白，并进行GO和KEGG分析（Fig.9B-9C）。10.Western-blot法结合RIP实验验证snord105b基因的结合蛋白结合质谱结果和生物信息学分析，我们选择评分较高的兴趣蛋白进行western-blot法和RIP验证。结果显示，通过western-blot法验证，我们发现snord105b正义链探针可特异性下拉ALDOA蛋白。通过RIP实验验证，我们发现利用ALDOA抗体可同时拉下snord105b基因，qPCR法检测结果具有统计学意义（P＜0.05）。综上所述，ALDOA蛋白可与snord105b基因相对特异性结合（Fig.10A-10C）。11.免疫荧光实验检测snord105b基因对ALDOA蛋白表达的影响49 研究论文利用激光共聚焦显微镜，观察发现ALDOA蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达。在SGC-7901细胞中，敲低snord105b基因表达，ALDOA蛋白的表达水平降低（Fig.11）。12.Snord105b基因对ALDOA及其下游C-myc蛋白表达水平的影响Westernblot法检测结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组ALDOA和C-myc蛋白相对表达水平分别为（0.43±0.05）和（0.28±0.03），snord105bsi-2转染组ALDOA和C-myc蛋白相对表达水平分别为（0.57±0.10）和（0.35±0.07），与si-nc转染组两种蛋白的表达水平（0.77±0.11）和（0.46±0.05）相比明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组ALDOA和C-myc蛋白相对表达水平为（0.93±0.09）和（0.66±0.06），与CD511B空质粒转染组两种蛋白的相对表达水平（0.74±009）、（0.49±0.13）相比升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组ALDOA和C-myc蛋白相对表达量水平分别为（0.28±0.03）和（0.48±0.11）、snord105bsi-2转染组ALDOA和C-myc蛋白相对表达水平分别为（0.52±0.12）和（0.35±0.07），与si-nc转染组两种蛋白的相对表达水平（0.77±0.04）和（0.62±0.05）相比下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组ALDOA和C-myc蛋白相对表达水平分别为（0.95±0.07）和（0.86±0.06），与CD511B空质粒转染组两种蛋白的相对表达水平（0.74±0.09）和（0.60±0.14）相比升高，差异具有统计学意义（Fig.12A-12C）（P＜0.05）。这些结果表明，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低或者过表达snord105b基因，影响ALDOA蛋白及其下游蛋白C-myc的表达水平。13.Snord105b表达水平改变对胃癌细胞EMT相关蛋白表达的影响Westernblot方法检测结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白相对表达水平分别为（0.46±0.08）、（0.17±0.04）和（0.39±0.01），snord105bsi-2转染组E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白相对表达水平分别为（0.47±0.10）、（0.26±0.09）和（0.63±0.04），与si-nc转染组三种蛋白的相对表达水平（0.31±0.04）、（0.45±0.07）和（0.77±0.05）相比，Vimentin和N-Cadherin蛋白表达下调，E-Cadherin蛋白的表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白相对表达50 研究论文水平分别为（0.45±0.07）、（0.59±0.13）和（1.01±0.07），与CD511B空质粒转染组三种蛋白的相对表达水平（0.59±0.13）、（0.48±0.02）和（0.78±0.06）相比，Vimentin和N-Cadherin蛋白表达升高，E-Cadherin蛋白的表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。AGS细胞是一种E-Cadherin缺失的细胞系，在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组Vimentin和N-Cadherin蛋白的相对表达水平为（0.23±0.11）和（0.48±0.03），snord105bsi-2转染组Vimentin和N-Cadherin蛋白的相对表达水平分别为（0.39±0.04）和（0.58±0.04），与si-nc转染组两种蛋白的相对表达水平（0.71±0.05）和（0.78±0.08）相比，Vimentin和N-Cadherin蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；snord105b质粒转染组Vimentin和N-Cadherin蛋白相对表达水平分别为（0.79±0.06）和（0.96±0.06），与CD511B空质粒转染组两种蛋白的相对表达水平（0.65±0.06）和（0.78±0.11）相比，Vimentin和N-Cadherin蛋白表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.13A-13D）。这些结果说明，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，敲低snord105b基因，上皮表型E-Cadherin蛋白表达升高，间质表型Vimentin和N-Cadherin蛋白表达降低；而过表达snord105b基因，上皮表型E-Cadherin蛋白表达降低，间质表型Vimentin和N-Cadherin蛋白表达升高。这提示，snord105b可能影响胃癌细胞的EMT过程，促进胃癌的进展。14.Snord105b基因表达水平改变对ALDOAmRNA表达水平的影响RT-qPCR方法检测结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组ALDOAmRNA的相对表达水平为（0.88±0.08），snord105bsi-2转染组ALDOAmRNA的相对表达水平为（1.05±0.14），与si-nc转染组相比，差异没有统计学意义（P>0.05）；snord105b质粒转染组ALDOAmRNA的相对表达水平为（0.91±0.19），与CD511B组相比，差异也没有统计学意义（P>0.05）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组ALDOAmRNA的相对表达水平为（0.93±0.07），snord105bsi-2转染组ALDOAmRNA的相对表达水平为（0.91±0.07），与si-nc转染组相比，差异没有统计学意义（P>0.05）；snord105b质粒转染组ALDOAmRNA的相对表达水平为（0.87±0.12），与CD511B组相比，差异也没有统计学意义（P>0.05）（Fig.14A-14B）。以上结果表明，snord105b基因表达不影响ALDOA基因的转录水平。51 研究论文15.Rescue验证snord105b基因是否通过ALDOA蛋白发挥生物学功能（1）构建过表达ALDOA基因的胃癌细胞株在胃癌细胞SGC-7901和AGS中分别转染ALDOA过表达质粒和pcDNA3.1空载体质粒，通过实时荧光定量PCR法验证ALDOA的转染效率。结果显示，在SGC-7901细胞中，ALDOA质粒转染组ALDOA的表达水平为（3.27±0.32），与pcDNA3.1空质粒转染组相比明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在AGS细胞中，ALDOA质粒转染组ALDOA的表达水平为（3.06±0.62），与pcDNA3.1空质粒转染组相比明显增加，差异具有统计学意义（Fig.15A）（P＜0.05）。Western-blot实验方法进一步验证了ALDOA的表达水平（Fig.15B）。以上结果提示，在胃癌细胞系SGC-7901和AGS中成功过表达ALDOA基因。（2）敲低snord105b基因同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞体外增殖能力的影响采用MTS法检测敲低snord105b基因同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞系SGC-7901和AGS体外增殖活性的影响。将各组细胞分别接种于96孔板后，在0h、24h、48h、72h、96h五个时间点，用酶标仪测定波长492nm处各组细胞的吸光度值。结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组的OD值分别为（0.18±0.02）、（0.24±0.09）、（0.36±0.06）、（0.61±0.13）、（0.75±0.07），snord105bsi-1+ALDOA转染组的OD值分别为（0.16±0.05）、（0.31±0.03）、（0.46±0.06）、（0.64±0.07）、（0.90±0.14），ALDOA转染组的OD值分别为（0.19±0.01）、（0.36±0.06）、（0.56±0.06）、（0.83±0.10）、（1.15±0.07），pcDNA3.1空质粒转染组的OD值分别为（0.17±0.01）、（0.32±0.01）、（0.55±0.05）、（0.75±0.07）、（1.03±0.11）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组的OD值分别为（0.17±0.01）、（0.20±0.03）、（0.29±0.02）、（0.38±0.04）、（0.45±0.04），snord105bsi-1+ALDOA转染组的OD值分别为（0.16±0.01）、（0.25±0.01）、（0.33±0.01）、（0.49±0.01）、（0.61±0.02），ALDOA转染组的OD值分别为（0.17±0.02）、（0.26±0.02）、（0.37±0.05）、（0.51±0.02）、（0.64±0.03），pcDNA3.1空质粒转染组的OD值分别为（0.18±0.01）、（0.20±0.01）、（0.31±0.02）、（0.43±0.02）、（0.53±0.04）。这些结果说明，敲低snord105b基因表达，可抑制胃癌细52 研究论文胞的增殖能力，过表达ALDOA基因可促进胃癌细胞的增殖活性，而敲低snord105b同时过表达ALDOA基因可部分恢复胃癌细胞的增殖活性，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.16A-16B）。（3）敲低snord105b同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞体外迁移功能的影响采用Transwell实验检测敲低snord105b同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞SGC-7901和AGS在体外迁移能力的影响。结果显示：在SGC-7901细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（20.10±5.46），snord105bsi-1+ALDOA转染组为（52.41±4.36），ALDOA质粒转染组为（65.33±4.51），pcDNA3.1空载体转染组为（38.67±6.51）。在AGS细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（30.15±4.06），snord105bsi-1+ALDOA转染组为（52.67±4.04），ALDOA质粒转染组为（64.67±4.51），pcDNA3.1空载体转染组为（42.67±6.81）。以上结果说明，敲低snord105b，可抑制胃癌细胞迁移，过表达ALDOA可促进胃癌细胞迁移，而敲低snord105b同时过表达ALDOA基因可部分恢复胃癌细胞的迁移能力，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.17A-17B）。（4）敲低snord105b同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞体外迁侵袭功能的影响采用Matrigel基质胶侵袭实验检测敲低snord105b同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞SGC-7901和AGS体外侵袭能力的影响。结果显示：在SGC-7901细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（24.35±3.61），snord105bsi-1+ALDOA转染组为（54.02±7.81），ALDOA质粒转染组为（72.67±7.10），pcDNA3.1空载体转染组为（37.33±6.81）。在AGS细胞中，每个高倍镜视野中的细胞平均数：snord105bsi-1转染组为（32.03±7.21），snord105bsi-1+ALDOA转染组为（57.33±5.51），ALDOA质粒转染组为（66.67±7.64），pcDNA3.1空载体转染组为（44.32±8.54）。以上结果说明，敲低snord105b基因表达，可抑制胃癌细胞侵袭，过表达ALDOA基因可促进胃癌细胞侵袭，而敲低snord105b同时过表达ALDOA基因可部分恢复胃癌细胞的侵袭能力，差异具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.18A-18B）。53 研究论文（5）敲低snord105b同时过表达ALDOA基因对胃癌细胞C-myc蛋白表达的影响Western-blot方法结果显示，在SGC-7901细胞中，snord105bsi-1转染组C-myc蛋白的相对表达量为（0.39±0.05），snord105bsi-1+ALDOA转染组为（0.78±0.03），ALDOA质粒转染组为（0.93±003），pcDNA3.1空载体转染组为（0.57±0.04）。在AGS细胞中，snord105bsi-1转染组C-myc蛋白的相对表达量为（0.46±0.06），snord105bsi-1+ALDOA转染组为（0.85±0.06），ALDOA质粒转染组为（1.20±0.14），pcDNA3.1空载体转染组为（0.66±0.06）。这些结果提示，敲低snord105b基因可降低癌基因C-myc蛋白的表达水平，过表达ALDOA基因可促进C-myc蛋白的表达水平，而敲低snord105b同时过表达ALDOA基因可部分恢复C-myc蛋白的表达水平，结果具有统计学意义（P＜0.05）（Fig.19A-19B）。54 研究论文附图图1构建敲低或者过表达snord105b基因的胃癌细胞株Fig.1Snord105bexpressioninSGC-7901andAGScellstransfectedwithsnord105b-si，snord105bsi-nc，snord105bandCD511BweredetectedbyqRT-PCR(A-B),*P<0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.图2MTS实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞增殖能力的影响Fig.2Effectofsnord105bonproliferationof(A)SGC-7901and(B)AGScellsweredetectedbyMTS.Dataarepresentedasmean±SDoftriplicatesamples,*P<0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.55 研究论文56 研究论文图3Transwell和划痕愈合实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞迁移能力的影响Fig.3Effectofsnord105bonmigrationofSGC-7901andAGScellsweredetectedbytranswellmigrationassays(A-B)andwoundhealingassays(C-F),*P<0.05,vs.si-nc/CD511Bgroup.图4Matrigel基质胶实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞侵袭能力的影响Fig.4Effectofsnord105boninvasionofSGC-7901andAGScellsweredetectedbyMatrigelinvasionassays(A-B),*P<0.05,vs.si-nc/CD511Bgroup.57 研究论文图5克隆形成实验检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞克隆形成能力的影响Fig.5Effectsofsnord105boncolonyformationof(A)SGC-7901andAGScellsweredeterminedbycolonyformationassays.(B)Statisticalanalysisofcolonynumber.Dataareshownasmean±SD.*P＜0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.图6流式细胞技术检测敲低snord105b基因对胃癌细胞周期的影响Fig.6Effectsofsnord105boncellcycleof(AandC)SGC-7901and(BandD)AGScellsweredeterminedbyflowcytometryusingPIstaining.58 研究论文图7流式细胞技术检测敲低snord105b基因对胃癌细胞早期凋亡的影响Fig.7Effectsofsnord105bonapoptosisof(A)SGC-7901and(C)AGScellsweredeterminedbyflowcytometryusingAnnexinV/PIstaining.Statisticalanalysisofapoptoticrates(BandD).Dataareshownasmean±SD.*P＜0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.59 研究论文图8Western-blot方法检测snord105b基因表达变化对胃癌细胞增殖、周期和凋亡相关蛋白表达的影响Fig.8Effectofsnord105bontheexpressionofproliferation-,cycle-andapoptosis-associatedproteinsinSGC-7901(AandC)andAGS(BandD)cellsbywestern-blot.*P＜0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.60 研究论文图9RNA-ChIRP实验寻找与snord105b基因相互结合的蛋白Fig.9RNA-ChIRPassaywasusedtodetecttheboundproteinsofsnord105b.(A)SDS-PAGEgelandsilverstainingshowingproteinsboundtosnord105b(redarrow)andsnord105bantisenseorinputwasusedasacontrol.GO(B)andpathwayassays(C)wereusedtoanalyzedtheproteinswhichmaybindwithsnord105b.图10Western-bolt法和RIP实验验证snord105b基因与ALDOA蛋白相互结合Fig.10ALDOAwasspecificallybindingwithsnord105b.(A)Westen-blot(B)RNAImmunoprecipitation(RIP)experimentswereperformedusingtheALDOAantibodytoimmunoprecipitateandprimerstodetectsnord105b.RIPenrichmentwasdeterminedasRNAassociatedtoALDOAIPrelativetoNegativecontrol(IgG).61 研究论文图11激光共聚焦显微镜观察敲低snord105b基因表达后ALDOA蛋白表达降低Fig.11Knockdownofsnord105binhibitedtheexpressionofALDOA.ImmunofluorescenceshowedthatALDOAwasmainlylocatedinnucleusandtheexpressionofALDOAwasdownregulatedbyknockingdownthesnord105b.图12Snord105b基因对ALDOA和C-myc蛋白表达水平的影响Fig.12Effectofsnord105bontheexpressionofALDOA(AandB)andC-myc(AandC)inGCcellsbywestern-blot.*P＜0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.62 研究论文图13Western-blot方法检测snord105b基因表达改变对胃癌细胞EMT相关蛋白表达的影响Fig.13Effectofsnord105bontheexpressionofEMT-associatedproteinsinSGC-7901(A-B)andAGS(C-D)cellsbywestern-blot.*P＜0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.63 研究论文图14Snord105b基因表达改变对ALDOAmRNA表达水平的影响Fig.14Effectofsnord105bontheexpressionofALDOAbyRT-qPCR.*P＜0.05vs.si-nc/CD511Bgroup.图15构建过表达ALDOA基因的胃癌细胞株Fig.15ALDOAexpressioninSGC-7901andAGScellstransfectedwithALDOAandpcDNA3.1weredetectedbyqRT-PCR(A)andwestern-blot(B),*P<0.05vs.pcDNA3.1group.64 研究论文图16敲低snord105b同时过表达ALDOA基因后部分恢复胃癌细胞的增殖能力Fig.16ProliferationofGCcellswithsnord105bknockdownandALDOAoverexpressionwasassessedbytheMTSassay,(A)SGC-7901and(B)AGS.*P<0.05vs.snord105b-sigroup.图17Transwell实验检测敲低snord105b同时过表达ALDOA基因后胃癌细胞的迁移能力Fig.17Effectofsnord105bknockdownandALDOAoverexpressiononthemigration(AandB)ofGCcellswasinvestigatedusingtheTranswellassay.Averagecountswerecollectedfromfiverandommicroscopicfields,*P<0.05vs.snord105b-sigroup.65 研究论文图18Matrigel基质胶实验检测敲低snord105b同时过表达ALDOA基因后胃癌细胞的侵袭能力变化Fig.18Effectofsnord105bknockdownandALDOAoverexpressionontheinvasion(AandB)ofGCcellswasinvestigatedusingtheMatrigelassay.Averagecountswerecollectedfromfiverandommicroscopicfields,*P<0.05vs.snord105b-sigroup.66 研究论文图19Western-blot实验检测敲低snord105b同时过表达ALDOA基因后胃癌细胞的C-myc蛋白的表达水平变化Fig.19Western-blotassay(AandB)showedtheexpressionofC-mycintheGCcellstransfectedwithsnord105bknockdownandALDOAoverexpression,*P<0.05vssnord105b-sigroup.67 研究论文讨论Snord105b基因是一种主要富集于细胞核，并在核糖体RNA和其他小RNA加工修饰中起重要作用的非编码RNA，可作为癌基因或者抑癌基[10]因参与肿瘤的发生发展。2002年，常等人首次证明snoRNAs参与肿瘤[14]的发生。他们发现H/ACA家族的h5sn2-snoRNA在正常大脑组织过表达，但是在发生脑膜瘤时表达降低。说明snoRNA-h5sn2作为抑癌基因，表达缺失参与脑膜瘤的进展。2012年，Mei等人发现，SNORA42可作为癌基因在非小细胞肺癌中表达升高，通过促进癌细胞的生长、侵袭和克隆[8]形成参与非小细胞肺癌的进展，且其表达水平与患者生存率密切相关。有研究报道称，在急性白血病细胞中，SNORD114-1基因变异体可通过Rb/p16信号通路调控细胞周期，使细胞阻滞在G0/G1期，并减少S期的[15]比例，抑制肿瘤细胞的生长。2015年，zheng等人发现在NSCLC组织中snord78基因表达升高。在该研究中，沉默snord78基因表达通过诱导[4]G0/G1期阻滞和细胞凋亡抑制细胞增殖。此外，其他一些研究发现snoRNA可通过影响肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为、周期凋亡、EMT过程及血管生成等方式，参与乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌[1-3,5,16]和白血病等恶性肿瘤的发生发展。本研究中，通过MTS、transwell、划痕愈合、克隆形成及流式细胞技术等多种方法检测snord105b基因表达改变对胃癌细胞生物学功能的影响，提示snord105b基因表达可促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力。敲低snord105b基因表达可缩短胃癌细胞周期的S期，并促进胃癌细胞的早期凋亡。这些结果说明，snord105b基因作为一种癌基因，在胃癌进展中发挥重要作用。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指上皮细[17]胞失去上皮细胞表型转化为间质细胞的复杂过程。越来越来多的研究表[18-21]明，EMT在多种肿瘤，包括胃癌的侵袭和转移中发挥重要作用。肿瘤细胞发生EMT后侵入周围组织，并通过循环系统的运输，发生远端转移[22]。这表明EMT是造成癌症进展的重要原因之一。在本部分实验中，我们检测胃癌细胞EMT蛋白的表达水平，发现敲低snord105b基因可降低间质表型Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达，而升高上皮表型E-Cadherin68 研究论文蛋白的表达；而过表达snord105b基因则出现相反的结果。提示snord105b基因可能通过EMT途径影响胃癌进展。ALDOA，即果糖-二磷酸醛缩酶A（aldolaseA，ALDOA），是一种糖代谢酶，催化1,6-二磷酸果糖生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮可逆反应。ALDOA可参与多种细胞功能，如肌肉收缩，细胞形态和运动的调节，ATP的合成等。有报道称，ALDOA是低氧诱导因子1-α（HIF-1A）的下游靶点，并且ALDOA可通过调控糖代谢、癌基因、上皮-间质转化和细胞周期等多种信号通路而影响多种肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移、血管[23,24]生成和耐药，例如骨肉瘤、肺鳞状细胞癌和肝癌等。Ji等人研究发现，在胰腺癌中，ALDOA通过调控c-Myc、HIF-1α等基因，促进胰腺癌细胞[25]的生长和转移，敲低ALDOA基因表达可抑制胰腺癌细胞发生EMT；并且在肺癌细胞、结肠癌细胞中，敲低ALDOA导致上皮标志物表达上调和间质标志物表达下调，说明ALDOA参与肿瘤细胞的EMT过程，促进[26,27]肿瘤的进展和转移。在本研究中，首先通过生物素结合RNA-ChIRP结合质谱分析发现一系列可能与snord105b基因相互作用的蛋白，并对这些蛋白进行GO和KEGG分析。随后，我们选择评分较高的兴趣蛋白进行western-blot方法与RIP实验验证，发现ALDOA蛋白与snord105b基因可相对特异性结合。随后，我们验证了snord105b基因对ALDOA转录和翻译水平的影响。发现snord105b基因影响ALDOA蛋白表达，而对其mRNA水平无影响。由于ALDOA可调控C-myc蛋白促进胰腺癌细胞的生长和转移，而C-myc是一个众所周知的癌基因，所以，接下来检测了snord105b基因对C-myc蛋白表达的影响，结果发现敲低snord105b基因可抑制胃癌细胞C-myc蛋白的表达，而过表达snord105b基因可促进C-myc蛋白的表达。最后，我们通过rescue实验，验证snord105b基因是否通过ALDOA蛋白发挥作用。在胃癌细胞SGC-7901和AGS中，我们通过MTS、transwell和western-blot等实验方法说明，敲低snord105b同时过表达ALDOA基因可部分恢复胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并部分恢复ALDOA下游蛋白C-myc的表达水平。综上结果提示snord105b基因可能通过ALDOA/C-myc途径促进胃癌细胞发生EMT，导致胃癌进展。在本部分研究中，对snord105b基因在胃癌细胞生物学功能及部分作用机制进行阐述，更多、更深层的机制还需进一步研究。这些结果对69 研究论文snord105b基因在胃癌进展中的作用和机制提供了理论依据，并为临床胃癌靶向治疗提供科学基础。小结体外实验中，在胃癌细胞SGC-7901和AGS中敲低snord105b基因，可抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成等能力，促进胃癌细胞的早期凋亡，减少细胞周期S期，发生G0/G1期阻滞。而过表达snord105b基因能够促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成等能力。这些现象可能由于snord105b基因与ALDOA蛋白相互作用，通过影响C-myc蛋白的表达水平，促进胃癌细胞发生EMT，并影响多种功能蛋白的表达有关，例如：MMP2、CyclinD1、CDK4、BCL-2和BAX等，最终促进胃癌的发生发展。参考文献1.DongXY,GuoP,BoydJ,etal.ImplicationofsnoRNAU50inhumanbreastcancer[J].JGenetGenomics,2009,36(8):447-454.2.DongXY,RodriguezC,GuoP,etal.SnoRNAU50isacandidatetumor-suppressorgeneat6q14.3withamutationassociatedwithclinicallysignificantprostatecancer[J].HumMolGenet,2008,17(7):1031-1042.3.YoshidaK,TodenS,WengW,etal.SNORA21-AnOncogenicSmallNucleolarRNA,withaPrognosticBiomarkerPotentialinHumanColorectalCancer[J].Ebiomedicine,2017,22(C):68-77.4.ZhengD,ZhangJ,NiJ,etal.SmallnucleolarRNA78promotesthetumorigenesisinnon-smallcelllungcancer[J].JExpClinCancerRes:CR,2015,34(1):49.5.ZhouF,LiuY,RohdeC,etal.AML1-ETOrequiresenhancedC/DboxsnoRNA/RNPformationtoinduceself-renewalandleukaemia[J].NatCellBiol2017,19(7):844-855.6.OkugawaY,ToiyamaY,TodenS,etal.ClinicalsignificanceofSNORA42asanoncogeneandaprognosticbiomarkerincolorectalcancer[J].Gut,70 研究论文2017,66(1):107-117.7.ChenL,HanL,WeiJ,etal.SNORD76,aboxC/DsnoRNA,actsasatumorsuppressoringlioblastoma[J].SciRep,2015,5(1):85-88.8.MeiYP,LiaoJP,ShenJ,etal.SmallnucleolarRNA42actsasanoncogeneinlungtumorigenesis[J].Oncogene,2012,31(22):2794-2804.9.MannoorK,LiaoJ,JiangF.SmallnucleolarRNAsincancer[J].Biochimicaetbiophysicaacta,2012,1826(1):121-128.10.RomanoG,VenezianoD,AcunzoM,etal.Smallnon-codingRNAandcancer[J].Carcinogenesis,2017,38(5):485-491.11.SchmittAM,ChangHY.LongNoncodingRNAsinCancerPathways[J].Cancercell,2016,29(4):452-463.12.LiD,LiuX,ZhouJ,etal.LongnoncodingRNAHULCmodulatesthephosphorylationofYB-1throughservingasascaffoldofextracellularsignal-regulatedkinaseandYB-1toenhancehepatocarcinogenesis[J].Hepatology,2017,65(5):1612-1627.13.LiangY,ChenX,WuY,etal.LncRNACASC9promotesesophagealsquamouscellcarcinomametastasisthroughupregulatingLAMC2expressionbyinteractingwiththeCREB-bindingprotein[J].CellDeathDiffer,2018.14.ChangLS,LinSY,LieuAS,etal.Differentialexpressionofhuman5SsnoRNAgenes[J].BiochemBiophysResCommun,2002,299(2):196-200.15.LiuksialaT,TeittinenKJ,GranbergK,etal.OverexpressionofSNORD114-3marksacutepromyelocyticleukemia[J].Leukemia,2014,28(1):233-236.16.DeAraujoOliveiraJV,CostaF,BackofenR,etal.SnoReport2.0:newfeaturesandarefinedSupportVectorMachinetoimprovesnoRNAidentification[J].BMCbioinformatics,2016,17(18):464.17.BrabletzT,KalluriR,NietoMA,etal.EMTincancer[J].NatureRevCancer,2018.18.CaoTT,XiangD,LiuBL,etal.FZD7isanovelprognosticmarkerandpromotestumormetastasisviaWNTandEMTsignalingpathwaysin71 研究论文esophagealsquamouscellcarcinoma[J].Oncotarget,2017,8(39):65957-65968.19.LiY,ChenT,ZhuJ,etal.HighALDHactivitydefinesovariancancerstem-likecellswithenhancedinvasivenessandEMTprogresswhichareresponsiblefortumorinvasion[J].BiochemBiophysResCommun,2018,495(1):1081-1088.20.ChoiY,KoYS,ParkJ,etal.HER2-inducedmetastasisismediatedbyAKT/JNK/EMTsignalingpathwayingastriccancer[J].WorldJGastroenterol,2016,22(41):9141-9153.21.YooYA,KangMH,LeeHJ,etal.SonichedgehogpathwaypromotesmetastasisandlymphangiogenesisviaactivationofAkt,EMT,andMMP-9pathwayingastriccancer[J].CancerRes,2011,71(22):7061-7070.22.TerryS,SavagnerP,Ortiz-CuaranS,etal.NewinsightsintotheroleofEMTintumorimmuneescape[J].MolOncol,2017,11(7):824-846.23.ChangYC,ChanYC,ChangWM,etal.FeedbackregulationofALDOAactivatestheHIF-1alpha/MMP9axistopromotelungcancerprogression[J].Cancerletters,2017,403(1):28-36.24.DuS,GuanZZ,HaoLH,etal.Fructose-BisphosphateAldolaseAisapotentialmetastasis-associatedmarkeroflungsquamouscellcarcinomaandpromoteslungcelltumorigenesisandmigration[J].PloSone,2014,9(1).25.JiSR,ZhangB,LiuJ,etal.ALDOAfunctionsasanoncogeneinthehighlymetastaticpancreaticcancer[J].CancerLetter,2016,374(1):127-135.26.KawaiK,UemuraM,MunakataK,etal.Fructose-bisphosphatealdolaseAisakeyregulatorofhypoxicadaptationincolorectalcancercellsandinvolvedintreatmentresistanceandpoorprognosis[J].IntJOncol,2016,50(2):525-534.27.ZhangF,LinJD,ZuoXY,etal.ElevatedtranscriptionallevelsofaldolaseA(ALDOA)associateswithcellcycle-relatedgenesinpatientswithNSCLCandseveralsolidtumors[J].BiodataMining,2017,10(1):6.72 研究论文第三部分敲低snord105b基因表达对裸鼠体内胃癌细胞成瘤能力的研究前言通过前两部分的实验研究，明确了snord105b基因在胃癌组织、胃癌患者血清及胃癌细胞系中表达升高，且与肿瘤大小、分化程度及TNM分期呈正相关。体外实验中，snord105b基因可促进胃癌细胞的增殖、迁移侵袭等生物学行为，而敲低snord105b基因可抑制胃癌细胞的上述功能。有研究报道，SNORA42基因作为一种癌基因，在非小细胞肺癌患者组织中表达升高，在肺癌细胞系中敲低SNORA42基因可诱导细胞凋亡，降低[1]其增殖能力，并减慢动物体内移植瘤的形成。Snord76基因作为一种抑癌基因在脑胶质瘤中表达降低，过表达snord76基因可抑制体内外恶性胶[2]质瘤细胞的生长和增殖。那么snord105b基因在体内对胃癌细胞的生长与增殖是否有影响？在本研究中，构建了稳定低表达snord105b基因的胃癌细胞株sh-snord105b-SGC-7901，将其接种于裸鼠皮下建立胃癌裸鼠移植瘤模型，探索体内snord105b基因表达对胃癌发生发展的影响。材料与方法1实验材料1.1细胞株人胃癌细胞株SGC-7901来自河北医科大学第四医院科研中心液氮冻存。1.2实验动物BALB/c-nu裸鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，4-6周龄，雄性，体重16-18g，许可证号：SCXK（京）2012-0001，共8只，由河北医科大学第四医院实验动物中心专人饲养。各项操作均符合河北医科大学第四医院实验动物相关规定。1.3主要实仪器设备73 研究论文防脱载玻片天津市百世化工有限公司盖玻片江苏世泰实验器材有限公司切片机（RM2135型）德国LEICA公司摊片烤片机（CS-VI型）孝感宏业医用仪器有限公司数显电热保温箱（303-4A）海阳光实验仪器有限公司其他仪器设备同前两部分。1.4主要试剂慢病毒包装试剂盒上海吉凯基因科技有限公司抗原修复液基因科技（上海）有限公司免疫组化检测试剂盒北京中衫金桥生物技术有限公司DAB显色试剂盒北京中衫金桥生物技术有限公司其他试剂同前两部分。2实验方法2.1细胞培养同第一部分。2.2细胞病毒侵染41）铺板：在稳转前一天，取对数生长期SGC-7901细胞3-5×10个/ml铺于六孔板中，培养过夜；2）第二天，弃去培基，用PBS清洗细胞两次，按公式：病毒体积=（MOI×细胞数目）/病毒滴度，计算相应的病毒量，同时加入Polybrene；3）24h后更换为含10%FBS的RPMI1640培养基，继续培养；4）感染成功的细胞会带有绿色荧光，72h后，在荧光显微镜下观察细胞的感染效率。2.3RT-qPCR方法检测感染效率方法同第一部分。2.4构建裸鼠皮下胃癌细胞移植瘤模型取4-6周龄的雄性BALB/c-nu裸鼠8只，将病毒感染后稳定低表达snord105b基因的sh-snord105b-SGC-7901细胞及对照组sh-nc-SGC-7901细胞，分别接种于裸鼠左右两侧肩胛下部皮下形成移植瘤，即左侧为sh-snord105b-SGC-7901细胞，右侧为：sh-nc-SGC-7901细胞，具体步骤如下：74 研究论文71）取对数生长期的各组细胞，消化并计数，调整浓度为：l×10/ml，4℃备用；2）用1ml注射器将细胞分别注射到裸鼠左、右两侧肩胛下部的皮下，每只100μl。无菌环境下饲养；3）每天观察裸鼠的精神状态和成瘤情况，待瘤体长度超过4mm时开2始测量，每3天测量一次，并按照V=longth×width÷2计算移植瘤的体积；4）一个月后，用脱颈法处死裸鼠，剥离移植瘤并称重、拍照。取部分瘤组织迅速放入-80℃冰箱备用，其余组织于10%福尔马林中固定。2.5免疫组化法检测移植瘤组织中Ki-67、ALDOA、C-myc及EMT相关蛋白的表达变化2.5.1组织切片用于免疫组化的载玻片先浸泡于浓酸酸缸中24h后，自来水反复漂洗，蒸馏水浸泡30min×2次，95%酒精浸泡2h，60℃烤箱中干燥后，再浸入APES:丙酮=1:49的混合液中1min，然后纯丙酮漂洗，于室温下晾干制成防脱片的载玻片。2.5.2标本制备所有组织标本均为常规石蜡包埋组织，制成厚4μm的病理切片，进行免疫组织化学染色。2.5.3采用SP法进行免疫组化染色，操作步骤如下：1）将组织切片放于67℃烤箱15-20min；2）浸入二甲苯I、II中分别脱蜡10min；3）组织切片于无水乙醇I、无水乙醇II、95%乙醇、80%乙醇中各5min，自来水冲洗，PBS缓冲液浸泡5min×2次；4）组织切片于3%甲醇过氧化氢中室温避光修复20min，以消除内源性过氧化物酶的活性；5）用蒸馏水冲洗后，于PBS缓冲液中中浸泡5min×2次；6）组织切片用pH=9.0的EDTA缓冲液进行高压热修复3min，冷却至室温后于PBS缓冲液中浸泡5min×2次；7）滴加正常羊血清工作液，于湿盒内37℃条件下封闭45min，倾去勿洗；75 研究论文8）滴加按不同比例稀释的Ki-67、ALDOA、C-myc、E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin一抗，4℃湿盒内过夜；9）第二天，弃去一抗，于PBS缓冲液中浸泡5min×2次。滴加生物素标记的二抗，37℃湿盒内孵育30min；10）PBS缓冲液浸泡5min×2次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃湿盒内孵育30min；11）PBS缓冲液浸泡5min×2次。DAB显色，蒸馏水终止显色。12）苏木素复染1.5min，过水三次，盐酸酒精一过，过水，蒸馏水中反蓝10min，过水，80%乙醇5min，95%乙醇5min，无水乙醇I5min无水乙醇II5min；13）封片：晾干后中性树胶封片，显微镜下观察。3统计学处理数据处理采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料以（XS）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.构建稳定低表达snord105b基因的胃癌细胞株用携带有干扰质粒的病毒液侵染胃癌细胞SGC-7901，72h后利用荧光显微镜观察细胞的侵染效率（Fig.1A）。随后，通过RT-qPCR方法进行验证，结果显示，sh-snord105b-SGC-7901细胞snord105b基因的表达水平是（0.12±0.05），与sh-nc-SGC-7901细胞相比明显降低，差异具有统计学意义（Fig.1B-C）（P<0.05），提示成功构建稳定低表达snord105b基因的SGC-7901胃癌细胞株。2.稳定低表达snord105b基因的胃癌细胞对裸鼠体内成瘤能力的影响我们选取8只4-6周龄的雄性裸鼠进行荷瘤实验，按其肩胛下左右两侧不同的接种细胞分为sh-snord105b转染组和sh-nc转染组，接种细胞数6为1×10，一周后，各组成瘤率均为100%。继续测量肿瘤体积大小，一个月后处死裸鼠，并进行各种指标检测。结果显示，sh-snord105b转染组裸76 研究论文鼠移植瘤明显小于sh-nc转染组（Fig.2A-2C）。皮下注射第25天时，sh-3snord105b转染组移植瘤平均体积为（716.65±178.35）mm，与sh-nc转染3组（1699.58±216.16）mm相比明显降低（Fig.2D），sh-snord105b转染组移植瘤平均重量为（0.47±0.19）g，与sh-nc转染组（1.05±0.35）g相比明显降低，这些结果均具有统计学意义（Fig.2E）（P<0.05）。结果表明，敲低snord105b基因表达使胃癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力降低、增殖减慢。3.裸鼠肿瘤组织snord105b基因表达及ALDOA蛋白表达采用RT-qPCR方法检测裸鼠肿瘤组织中snord105b基因的表达水平。结果显示，在sh-snord105b-SGC-7901细胞形成的移植瘤组织中，snord105b基因的表达水平为（0.51±0.15），与sh-nc转染组相比明显降低，差异具有统计学意义（Fig.3A-B）（P<0.05）。利用western-blot方法检测裸鼠移植瘤组织内ALDOA蛋白的表达水平。结果显示，在sh-snord105b-SGC-7901细胞形成的移植瘤组织中，ALDOA蛋白的表达水平为（0.12±0.02），与sh-nc转染组（0.66±0.19）相比明显降低，差异具有统计学意义（Fig.3C-D）（P<0.05）。这些结果提示，在snord105b基因低表达的肿瘤组织内，ALDOA蛋白的表达水平亦降低，snord105b基因的表达水平影响ALDOA蛋白的表达水平。4.裸鼠移植瘤组织中增殖抗原Ki-67、ALDOA和C-myc蛋白的表达水平为了进一步确定snord105b基因在体内是否可以与ALDOA蛋白相互结合，影响C-myc蛋白的表达水平，促进胃癌的增殖活性。我们采用免疫组织化学法（IHC）检测Ki-67、ALDOA和C-myc蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达水平。结果显示，在sh-snord105b-SGC-7901细胞形成的肿瘤组织中，Ki-67、ALDOA和C-myc蛋白的表达水平分别是（4.65±0.92）、（3.52±0.70）和（2.55±0.72），与sh-nc转染组这三种蛋白的表达水平（8.25±0.35）、（7.12±1.41）和（5.51±0.68）相比，明显降低（Fig.4）（P<0.05）。这表明，snord105b基因确实可通过ALDOA蛋白，影响C-myc蛋白表达，促进胃癌细胞的增殖活性。5.裸鼠移植瘤组织中EMT相关蛋白的表达水平采用免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤组织内E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达水平。结果显示，这些蛋白主要分布于细胞浆，在77 研究论文sh-snord105b-SGC-7901细胞形成的肿瘤组织中，Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达水平分别是（2.52±0.71）和（2.64±0.57），与sh-nc转染组两种蛋白的表达水平（5.25±1.06）和（5.12±0.57）相比明显降低，而E-Cadherin的表达水平是（5.52±0.71），与sh-nc转染组E-Cadherin的表达水平（1.25±0.35）相比明显升高，结果具有统计学意义（Fig.5）（P<0.05）。这说明，snord105b基因在体内仍然影响胃癌细胞的EMT过程，敲低snord105b基因表达可抑制胃癌细胞发生EMT。78 研究论文附图图1SGC-7901细胞构建稳定低表达snord105b基因的胃癌细胞株Fig.1Expressionofsnord105binSGC-7901cellstransfectedwithsh-snord105bweredetectedbyFluorescencemicroscop(A)andRT-qPCR(B),*P<0.05vs.sh-ncgroup.图2低表达snord105b基因的胃癌细胞株抑制裸鼠成瘤能力Fig.2Knockingdownsnord105binhibitedGCcellgrowthinvivo.(A-C)Thegrowthofsh-snord105b-SGC-7901cellsandsh-nc-SGC-7901cellsthatwereinjectedsubcutaneouslyintonudemice(n=7).(D)Tumorsizeand(E)tumor*weightweremeasured,P<0.05vs.sh-ncgroup.79 研究论文图3Snord105b基因在裸鼠移植瘤组织中的表达水平Fig.3Expressionofsnord105bintumortissuesofnudemice.*(A-B)RT-PCR,(C-D)western-blot,P<0.05vs.sh-ncgroup.sh-nc10sh-snord105b86***score4*Immunoreactive20Ki-67ALDOAC-myc图4ALDOA、C-myc和Ki-67蛋白在裸鼠移植瘤组织中的表达Fig.4ExpressionofALDOA、Ki-67andC-mycproteins(brown)intumor*tissuesfromthetwogroupsofnudemice,P<0.05vs.sh-ncgroup.80 研究论文sh-nc8sh-snord105b6*4score**2Immunoreactive0VimentinE-CadherinN-Cadherin图5EMT相关蛋白在胃癌细胞裸鼠移植瘤中的表达Fig.5ExpressionofEMT-associatedproteins(brown)intumortissuesfromthetwogroupsofnudemice,*P<0.05vs.sh-ncgroup.81 研究论文讨论胃癌是全球常见的恶性肿瘤，预后较差，且高发于发展中国家。我国是胃癌的高发国家，发病和死亡例数均占世界发病和死亡例数的50%，疾病负担严重，是癌症防治的重点工作之一。然而，胃癌病因病理机制仍不清楚，饮食、环境、感染和基因等因素均影响其发生发展。大多数早期胃癌没有明显的临床症状，被诊断时已处于晚期，手术可切除率低，容易发生转移复发。因此，明确胃癌发生发展的分子生物学机制，寻找胃癌早期诊断标志物和治疗的有效基因靶点，对于胃癌的诊断和治疗具有重要的理论意义和应用价值。在过去十年间，研究者对比了肿瘤组织及其相应的癌旁正常组织中snoRNA的表达水平，并筛选出许多差异表达的snoRNA，有研究报道snoRNA可能与肿瘤的发生密切相关。通过多种分子生物学实验，研究者证明一些snoRNA确实可作为癌基因或者抑癌基因参与细胞的转化，导致[3,4]肿瘤生成。在2010年，Liao等人首次进行人类肿瘤组织snoRNA表达谱分析。值得注意的是，与正常组织相比，肿瘤组织中高表达一系列snoRNAs。在这篇研究中，他们提出通过RT-qPCR技术检测血浆snoRNAs[5]可作为一种NSCLC的潜在诊断方法。随后，H/ACAboxsnoRNA-[6]SNORA42被广泛研究。用siRNA敲低SNORA42基因表达导致肿瘤细胞生长减少，通过诱导p53依赖性肿瘤凋亡，阻碍动物模型的肿瘤生成。[1]相反，过表达SNORA42基因激活癌细胞的生长。在2015年，zheng等人发现在NSCLC组织中snord78基因表达升高。在该研究中，沉默snord78基因通过诱导G0/G1期阻滞和细胞凋亡抑制细胞增殖。SnoRNA表达谱在诊断某些亚型的外周血T细胞淋巴瘤和癌症病人化疗用药预测上是有效的。2012年，Blood杂志报道，与正常组织相比，多种snoRNAs在T[7]细胞淋巴瘤细胞中广泛下调。此外，snoRNA可作为多种肿瘤的诊断标[8]志物。有报道称，SNORA21基因在结肠癌组织中表达升高，可作为结肠癌预后不良的独立预测因素。SNORA42基因可作为结肠癌诊断的分子[9]标志物，snoRNA的差异表达也可作为口腔鳞状细胞癌的潜在诊断标志[10]物。在本研究的前期结果表明，snord105b基因可以在体外通过82 研究论文ALDOA/C-myc信号通路，影响胃癌的增殖、迁移、侵袭和EMT途径，从而促进胃癌进展。本部分实验在体内对此进行了进一步的验证，结果显示，敲低snord105b基因的裸鼠胃癌移植瘤与对照组相比明显减小，ALDOA蛋白、C-myc蛋白、增殖及EMT相关蛋白表达明显降低。以上结果提示，与体外实验结论一致，敲低胃癌细胞snord105b基因的表达可抑制体内胃癌细胞的增殖与转移。小结敲低snord105b基因表达可抑制体内裸鼠胃癌移植瘤的形成。这可能是通过snord105b基因与ALDOA蛋白相互结合，促进癌基因C-myc的表达和胃癌细胞的EMT过程，从而影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学功能，最终导致胃癌的进展。参考文献1.MeiYP,LiaoJP,ShenJ,etal.SmallnucleolarRNA42actsasanoncogeneinlungtumorigenesis[J].Oncogene,2012,31(22):2794-2804.2.ChenL,HanL,WeiJ,etal.SNORD76,aboxC/DsnoRNA,actsasatumorsuppressoringlioblastoma[J].Scientificreports,2015,5(8588).3.ZhouF,LiuY,RohdeC,etal.AML1-ETOrequiresenhancedC/DboxsnoRNA/RNPformationtoinduceself-renewalandleukaemia[J].NatCellBiol,2017,19(7):844-855.4.WilliamsGT,FarzanehF.AresnoRNAsandsnoRNAhostgenesnewplayersincancer?[J].NatRevCancer,2012,12(2):84-88.5.LiaoJP,YuL,MeiYP,etal.SmallnucleolarRNAsignaturesasbiomarkersfornon-small-celllungcancer[J].Molcancer,2010,9(1):1-10.6.OkugawaY,ToiyamaY,TodenS,etal.ClinicalsignificanceofSNORA42asanoncogeneandaprognosticbiomarkerincolorectalcancer[J].Gut,2017,66(1):107-117.7.ValleronW,YsebaertL,BerquetL,etal.SmallnucleolarRNAexpression83 研究论文profilingidentifiespotentialprognosticmarkersinperipheralT-celllymphoma[J].Blood,2012,120(19):3997-4005.8.YoshidaK,TodenS,WengW,etal.SNORA21-AnOncogenicSmallNucleolarRNA,withaPrognosticBiomarkerPotentialinHumanColorectalCancer[J].EBioMedicine,2017,22(C):68-77.9.ZhengD,ZhangJ,NiJ,etal.SmallnucleolarRNA78promotesthetumorigenesisinnon-smallcelllungcancer[J].JExpClinCancerRes:2015,34(1):1-15.10.Chamorro-PetronacciC,Perez-SayansM,Padin-IruegasME,etal.DifferentialexpressionofsnoRNAsinoralsquamouscellcarcinomas:newpotentialdiagnosticmarkers[J].JEnzymeInhibMedChem,2018,33(1):424-427.84 研究论文第四部分LncRNA-NR_109861在肿瘤相关巨噬细胞中的表达及在胃癌微环境TAM中作用的实验研究前言肿瘤微环境由基质细胞包括成纤维细胞、上皮细胞和多种类型的免疫[1]细胞及其分泌的细胞因子构成，在肿瘤进展转移中发挥重要作用。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-AssociatedMacrophage,TAM）是肿瘤微环境中最重要的免疫细胞。临床和流行病学研究发现，在许多肿瘤中，TAM的密度[2]与较差的预后存在密切联系。巨噬细胞大致可分为两种类型，即经典活化途径的M1型巨噬细胞和替代性活化途径的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可分泌IL-6、IL-12和TNF-α等细胞因子，促进炎症反应，发挥抗肿瘤作用。M2型巨噬细胞可分泌IL-10和TGF-β等细胞因子，抑制机体免疫反应，促进肿瘤细胞的侵[3]袭转移。肿瘤早期，TAM主要表现为M1型巨噬细胞，而在晚期肿瘤中，TAM大多表现为M2型巨噬细胞，所以TAM的极化影响肿瘤的转归。深入研究TAM的极化机制，将对肿瘤的治疗具有重要意义。非编码RNA在肿瘤的发生和进展中发挥重要作用。这些RNA根据他们的大小和产生的途径被分为许多家族，长链非编码RNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA。很多lncRNA在不同组织和病理生理过程有不同的表达，说明他们具有重要的生物学作用。LncRNA通过调节[4,5]转录、转录后调控和增加RNA降解等方式调节细胞功能。目前，很少有研究报道lncRNA在巨噬细胞极化过程中的作用。本研究的目的是，寻找与M0细胞相比，M2型巨噬细胞中差异表达的lncRNA分子，探索其在TAM极化中的作用，为临床肿瘤治疗提供新靶点和新思路。85 研究论文材料与方法1实验材料1.1组织标本同第一部分研究。1.2外周血标本同第一部分研究。1.3细胞株人单核细胞白血病永生化细胞株THP-1购自ATCC细胞库，保存于河北医科大学第四医院科研中心-150℃冰箱。1.4主要仪器设备同第一、第二部分研究。1.5主要试剂PMA美国Sigma公司重组人IL-4美国Peprotech公司重组人LPS美国Sigma公司重组人IFN-γ美国Peprotech公司重组人GM-CSF美国Peprotech公司人IL-12ELISA试剂盒美国eBioscience公司人IL-10ELISA试剂盒美国eBioscience公司人TNF-αELISA试剂盒美国eBioscience公司人TGF-βELISA试剂盒美国eBioscience公司FITC标记的抗CD206抗体美国eBioscience公司PE标记的抗CD163抗体美国eBioscience公司FITC标记的抗CD86抗体美国eBioscience公司PE标记的抗CCR7抗体美国eBioscience公司上述流式抗体同型对照抗体美国eBioscience公司其他试剂同第一部分研究。2实验方法2.1细胞培养THP-1细胞于37℃、5%CO2条件下，培养于含10%胎牛血清的RPMI86 研究论文1640培养基中（含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）。每2-3d补液或更换新鲜培养基一次，于倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，取对数生长期细胞用于实验研究。2.2M0、M1和M2细胞的诱导用50ng/mlPMA作用于THP-1细胞，48h后细胞贴壁成为M0型巨噬细胞。用新鲜含10%FBS的RPMI1640培养基换液并使M0细胞静息24h后，加入100ng/mlLPS和20ng/mlIFN-γ诱导48h成为M1型巨噬细胞，或者20ng/mlIL-4诱导48h成为M2型巨噬细胞。2.3RT-qPCR法分析各种基因的表达水平，引物序列如下表所示：基因名称引物序列（5’-3’）Forward:GCAAGGTGATGGAAGAAAArg-1Reverse:CTGGTGTGAAAGATGGGTForward:GGAGAACCTGAAGACCCTIL-10Reverse:GGCTTTGTAGATGCCTTTCForward:GACTTCAGCCTGGACAACGATGF-βReverse:TGTAGGGGTAGGAGAAGCCCForward:CCTCATTGCTACTGCCCTCTCCL5Reverse:GTTCAGCCGGGAGTCATACAForward:CGTGTGCACCTACCTCAAGACD206Reverse:AAGGACAGACCAGTACAATTCAGTAForward:CTTGCCTTGCTGCTCTACCTVEGFReverse:TCTCTCCTATGTGCTGGCCTForward:TTTCCGTGAAAACGGAGCTGTNF-αReverse:CACCCACAAGAAGAGGCAGATForward:GGCGGCTTGAAGAATTTGGACHLA-DRaReverse:CATTGGTGATCGGAGTATAGTTGGAForward:AGGACCTAGCCTCGTGAAACIL-12Reverse:TGGCTGTGTCCTCAGTAGTCForward:CCATCATGGACCACCACACAiNOSReverse:TCCGCATTAGCACAGAAGCAGAPDHForward:CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC87 研究论文Reverse:GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTCForward:GGCCAAACTGCCGAGGATTAlnc-AL139008.2-3:2Reverse:AGTTCACTCAGGTGTCCTACCForward:ACATTACTCCCCACAGGACTTClnc-CLEC7A-2:1Reverse:CAGCGCCTCGGACTCTAAATForward:AAACTGCCGAGGATTATGlnc-AL139008.2-3:3Reverse:GACTGGTGATAGAGCGAGACForward:GAGGCAGAGAGAGAAGTGTGENST00000562942Reverse:GCTGGGGAGAGGAAGTAGForward:TTGAGATGTCGAGAGCGAGCNR_109861Reverse:CTTGGGCTGTGCTGAGACTAForward:GTGCTTTCTTTGATGTTCCTENST00000540392Reverse:GATTTCTCTTCTTGGTTTTCTGForward:TCTCCCTTTACCACACCAENST00000602461Reverse:TTTCCATTCTCTTCCTTTCTTForward:CCAGACAGAACCAAGCACENST00000424435Reverse:TGAAATAGCAGGCGAGAGForward:CTCCACCAAATCCACAAANONHSAT101069Reverse:TAACACAAACGACCAAGACAForward:TCTCTTCAGCCAATCTTCAlnc-IL1A-3:1Reverse:TAGTCTTACCTTCATCTGTTTAGGForward:GGGGAACAGAGGAGAAGAlnc-GNLY-2:6Reverse:CAGACGAGAGAAGACCAGACForward:CAACTCTTTGCTCTGGGAlnc-CLDN20-1:1Reverse:CTTCCTCTCTGATGTTTGGAForward:TCTGGAACTATGGGCTTGlnc-EIF2AK4-7:1Reverse:CATTTTCTTGAGGCAGGTForward:AAGGTAGAAGGTGGGGTCTNR_024603Reverse:TAACTGGAGATGCTGGATGForward:GCCTGAATGTGTAGAACAAGALnc-PTTG1-1:2Reverse:AAAGAGACCAAATGAAAGCA88 研究论文实验方法同第一部分研究。2.4ELISA方法分析细胞培养上清中各种细胞因子的表达水平（以IL-12为例）1）实验前将所有试剂，包括样本，平衡至室温，至少30min；2）按说明书进行溶液配制，包括1×洗涤缓冲液和1×分析缓冲液；3）样本预处理：将样本与分析缓冲液（1×）按1:10的比例稀释（比例可调整），即：20μl样本+180μl分析缓冲液（1×），混匀备用；4）根据检测样品数量和适当的标准品、空白对照数量计算好所需微量孔数量。每个样本、标准品、空白对照均应加做副孔。从支架上取下额外的微量孔条板，放在密封的装有干燥剂的箔袋内，贮存于2-8℃；5）每个微量孔用400ul洗涤缓冲液（1×）洗涤两次，洗涤间期要将微量孔内容物彻底吸出，洗涤缓冲液在微量孔存留10-15s，切记不要划伤微量孔表面。最后一次洗涤后，倒空微量孔内容物，在纸巾上轻叩，去除额外的洗涤缓冲液。洗涤完成后立即使用微量孔条板，或者微量孔条板可倒放在一张浸湿的纸巾上不超过15min。切记不能让微量孔干燥；6）微量孔标准品的稀释：加入蒸馏水重建人IL-12p40标准品（重建好的标准品浓度=4ng/ml）。将所有标准品微量孔及副孔内加入100μl分析缓冲液（1×）。用移液枪将双份100μl准备好的标准品分别加入A1、A2。反复混匀，再分别吸取100μl加入B1、B2，继续此程序5次，保证七个浓度梯度。建立两列浓度梯度从2000至31pg/ml的人IL-12p40标准品稀释液。注意不要划伤微量孔内壁。丢弃从最后2个微量孔（G1、G2）中吸出的液体。重建好的标准品可放置10-30min，使用剩余的标准品应丢弃；7）加样：在标准品孔中按浓度加入100μl标准品稀释液，在空白孔中加入100μl样本稀释液，在样品空中加入100μl预处理待测样品，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；8）准备生物素共轭物（Biotin-Conjugate）：在一个干净的塑料管内，用分析缓冲液（1×）将一定量的生物素共轭物稀释成1:100的稀释液，在各微量孔中加入50μl生物素共轭物；9）温育：用封板膜封板后，室温下（18-25℃）用微板振荡器以400rpm的速度振荡2h；89 研究论文10）准备抗生蛋白链菌素（Streptavidin）-HRP：在一个干净的塑料管内，用分析缓冲液（1×）将一定量的抗生蛋白链菌素-HRP稀释成1:250的稀释液，稀释后应在30min内使用；11）洗涤：移除封板膜，弃去微量孔内液体。洗板6次；12）在各微量孔中加入100μl稀释好的Streptavidin-HRP，包括空白对照孔，盖上封板膜，室温下（18-25℃）用微板振荡器以400rpm的速度振荡1h；13）洗涤：移除封板膜，弃去微量孔内液体。洗板6次；14）底物显色：用移液枪向所有微量孔内加入100μlTMB底物溶液，室温下（18-25℃）孵育10min，避免强光照射（避光）。在浓度最高的标准孔显色为深蓝色时，加入终止液；15）终止反应：向每个微量孔用移液枪快速加入100μl终止液，终止酶反应。加入终止液后立即检测，或者于2-8℃避光保存，在1h内检测完毕；16）使用分光光度计，以波长450nm检测各个微量孔吸光度。2.5外周血单个核细胞（PBMC）的分离及PBMC源性M2型巨噬细胞的诱导1）在肝素抗凝条件下，采集健康献血者或者胃癌患者外周血2～3ml，加入少量PBS缓冲液，稀释外周血，轻轻混匀；2）采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。在无菌15ml离心管中加入淋巴细胞分离液5ml，用无菌移液管将稀释血液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液上层，使稀释血液轻轻铺在淋巴细胞分离液的表面，形成明显界面，稀释血液与淋巴细胞分离液的体积比例为1:1；3）25℃，2100rpm离心15min，血液被分为四层，由下到上分别是红细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血浆层。PBMC处于白膜层，用吸管将此层移入另一支无菌离心管中；4）洗涤细胞两次：加入10mlPBS溶液充分洗涤白膜层细胞，25℃，离心：1500rpm，10min，弃去上清液，获得PBMC；5）将PBMC悬于含10%FBS的RPMI1640培养基中，加入6孔培养板中，1ml/孔，并加入50ng/mlGM-CSF，37℃、5%CO2培养箱中培养5-7d；90 研究论文6）培养第7d时，倒置显微镜下观察，弃去悬浮细胞后，贴壁且伸长的细胞为外周血PBMC诱导的M2型巨噬细胞，根据后续操作要求，直接加入TRIZOL提取RNA。2.6组织TAM的分离1）获取胃癌肿瘤组织和相应的癌旁正常组织后，修剪去除结缔组织，用RPMI1640培养基冲洗干净，放入平皿中；2）用眼科剪将肿瘤组织剪碎至l~2mm3小块，置于5mlRPMI1640消化液（含2%FBS，0.05%胶原酶IV，0.005%DNaseI）中，转移到15ml离心管中混匀，37°C，150rpm振荡1~2小时；3）用100目筛网过滤消化后的细胞悬液，去除未消化好的肿瘤组织块，重复过滤一次，50g离心1min，去除残留组织块；4）取上清400g离心l0min，沉淀重悬于2ml含1%小牛血清的RPMI1640培养基中；5）在6cm细胞培养皿内预先加入4ml左右含1%小牛血清的RPMI1640培养基，将前一步的细胞重悬液加入平皿，在37℃，5%CO2培养箱中培养1小时；6）将培养皿取出，去掉细胞悬液，PBS冲洗两遍后得到的贴壁细胞即为TAM。根据后续操作要求，直接加入TRIZOL提取RNA。3统计学分析数据处理采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料以（XS）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.THP-1细胞诱导的M0、M1和M2型巨噬细胞的形态变化利用倒置显微镜下观察，THP-1细胞为透明且折光性较强的圆形悬浮细胞，加入PMA诱导48h后细胞贴壁成为M0型巨噬细胞。在M0细胞中加入细胞因子LPS和IFN-γ诱导48h后，细胞变形且明显伸长，成为长梭形的M1型巨噬细胞。或者在M0细胞中加入细胞因子IL-4诱导48h后，细胞变形但不如M1明显，成为M2型巨噬细胞（Fig.1）。综上所述，91 研究论文M0、M1和M2型巨噬细胞在形态上有所区别。2.THP-1细胞诱导的巨噬细胞中M1和M2型分子标志物的表达水平RT-qPCR和RT-PCR方法检测，THP-1细胞诱导的M1和M2型巨噬细胞中M1型分子标志物：INOS、HLA-DRα、IL-12、TNF-α和CCL5，以及M2型标志物：Arg-1、CD206、IL-10、TGF-β、CCL22和VEGF的表达水平。结果显示，M1型巨噬细胞中INOS、HLA-DRα、IL-12、TNF-α和CCL5的表达水平分别是（1.94±0.81）、（39.60±4.47）、（3.01±2.26）、（3.10±0.45）和（35.61±5.04），与M0细胞相比明显升高，结果具有统计学意义（P<0.05）；M2型巨噬细胞中Arg-1、CD206、IL-10、TGF-β、CCL22和VEGF的表达水平分别为（5.23±0.36）、（72.17±4.83）、（7.14±2.26）、（7.81±1.21）、（4.83±1.52）和（2.26±1.55），与M0细胞相比明显升高，结果具有统计学意义（P<0.05）（Fig.2A-2B）。流式细胞技术检测，THP-1细胞诱导的M1和M2型巨噬细胞表面CD86/CCR7和CD206/CD163分子的表达水平。结果显示，M0、M1和M2细胞表面CD86/CCR7分子的表达水平分别为（29.85±2.90）、（42.10±2.41）和（23.10±5.09），其中M1与M0细胞相比，CD86/CCR7分子的表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），M2与M0细胞相比，CD86/CCR7分子的表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；M0、M1和M2细胞表面CD206/CD163分子的表达水平分别为（38.01±2.83）、（15.10±3.25）和（48.45±3.75），其中M2与M0细胞相比，CD206/CD163分子的表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），M1与M0细胞相比，CD206/CD163分子的表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）（Fig.2C-2D）。PCR和流式细胞技术结果均提示，与M0细胞相比，M1细胞高表达HLA-DRα和IL-12等M1型标志物分子，M2细胞高表达CD206和IL-10等M2型标志物分子，提示成功建立了M1和M2型巨噬细胞。3.THP-1细胞诱导的巨噬细胞培养上清中细胞因子的分泌水平ELISA方法检测经THP-1诱导的M0、M1和M2型巨噬细胞培养上清中M1型细胞因子：IL-12和TNF-α，以及M2型细胞因子IL-10和TGF-β的表达水平。结果显示，M0、M1和M2型巨噬细胞培养上清中IL-12（ng/ml）的表达水平分别是（0.31±0.03）、（0.98±0.37）和（0.29±0.02），92 研究论文其中M1细胞培养上清中IL-12的表达水平显著高于M0和M2细胞的培养上清，结果具有统计学意义（P<0.05）；三种细胞培养上清中TNF-α（ng/ml）的表达水平分别是（0.92±0.11）、（2.09±0.14）和（0.27±0.19），其中M1细胞培养上清中TNF-α的表达水平显著高于M0细胞的培养上清，且M2细胞培养上清TNF-α的表达水平显著低于M0细胞的培养上清，结果具有统计学意义（P<0.05）。三种巨噬细胞培养上清中IL-10（pg/ml）的表达水平分别是（30.19±2.62）、（19.01±4.24）和（41.45±3.30），其中M2细胞培养上清中IL-10的表达水平与M0细胞培养上清相比明显升高，且M1细胞培养上清中IL-10的表达水平明显低于M0细胞的培养上清，结果具有统计学意义（P<0.05）；三种细胞培养上清TGF-β（ng/ml）的表达水平分别是（0.28±0.01）、（0.22±0.01）和（0.39±0.03），其中M2细胞培养上清中TGF-β的表达水平明显高于M0细胞的培养上清，结果具有统计学意义（P<0.05）。以上结果再次证明，我们成功利用THP-1细胞构建了M0、M1和M2型巨噬细胞。4.筛选不同巨噬细胞中差异表达的lncRNA为了寻找M2型巨噬细胞中差异表达的lncRNA，我们将构建成功的M0、M1和M2型巨噬细胞分别提取RNA，进行lncRNA芯片杂交（AgilentSBC-lncRNAV6chip，规格：4×180K）。该芯片上设计的探针包括约77103个lncRNAs，然后对M2和M0芯片杂交后的微点阵列进行分析。其中有两倍以上变化（foldchange>2,P<0.05）的lncRNA被认为是差异表达lncRNA，共发现945条差异lncRNA，与M0组相比，M2组中表达上调的lncRNA共719条，表达下调表达的lncRNA共226条（Fig.4A）。从这些差异表达的lncRNAs中，随机选取（FoldChange≥2）8条表达上调的lncRNA和7条表达下调的lncRNA，进行qPCR技术验证。结果显示，这15条差异lncRNA在经THP-1诱导的M2型巨噬细胞中的表达趋势与芯片结果一致，说明芯片结果较为可靠（Table.1）。综合NONCODE、NCBI等数据库和芯片分析结果，我们发现lncRNA-NR_109861是一条位于20p12，长度为808bp，且在外周血白细胞中不表达的lncRNA（Fig.4B-4C）。基因芯片分析结果显示，NR_109861在M2中显著升高，是M0细胞的7.85倍，qPCR验证结果与芯片结果趋势一致（Table.1）。综上所述，选择lncRNA-NR_109861进行后续实验研究。93 研究论文5.LncRNA-NR_109861在人外周血单个核细胞诱导的巨噬细胞中的表达水平分离健康献血者（N=10）和胃癌患者（N=16）外周血单个核细胞（PBMC），并加入刺激因子GM-CSF诱导其分化为M2型巨噬细胞(Fig.5A)。RT-qPCR方法检测NR_109861基因在PBMC及PBMC源性的M2型巨噬细胞中的表达水平。结果显示，健康献血者PBMC源性的M2细胞和胃癌患者PBMC源性的M2细胞NR_109861基因的表达水平分别是（20.43±10.82）和（22.16±7.45），与PBMC细胞（1.02±1.23）相比明显升高，结果具有统计学意义（P<0.05）。而且，健康献血者PBMC和胃癌患者PBMC诱导的M2型巨噬细胞中，NR_109861基因的表达水平无差异（P>0.05）(Fig.5B)。这些结果表明，外周血来源的M2型巨噬细胞中，lncRNA-NR_109861表达升高。6.LncRNA-NR_109861在胃癌组织TAM中的表达水平分离胃癌组织（N=6）及相应正常组织（N=6）中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM），RT-qPCR方法检测TAM中NR_109861基因的表达水平。结果显示，胃癌组织TAM中NR_109861基因表达水平是（5.28±2.92），明显高于相应正常组织TAM（2.83±1.32）的表达水平，结果具有统计学意义（P<0.05）（Fig.6）。说明，胃癌组织中TAM主要表现为M2型巨噬细胞，且其高表达lncRNA-NR_109861。7.敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞中分子标志物的表达水平RT-qPCR方法检测在M2型巨噬细胞中敲低NR_109861基因表达后，M1型分子标志物：HLA-DRα、INOS、CCL5和IL-12，以及M2型分子标志物：CD206、Arg-1、CCL22、TGF-β和IL-10的表达水平。结果显示，在M2型巨噬细胞中敲低NR_109861基因后，si-1和si-2转染组细胞NR_109861基因的表达水平分别是（0.45±0.14）和（0.67±0.23），与si-nc转染组相比明显降低，说明M2型巨噬细胞中NR_109861基因成功被敲低（Fig.7A）。两个敲低组细胞HLA-DRα基因的表达水平分别是（2.72±0.25）和（1.82±0.46），INOS基因的表达水平分别是（1.68±0.42）和（1.27±0.33），CCL5基因的表达水平分别是（2.34±0.31）和（1.67±0.19），IL-12基因的表达水平分别是（2.36±0.35）和（1.79±0.15），与si-nc转94 研究论文染组的表达水平相比明显升高，结果均具有统计学意义（P<0.05）（Fig.7B）；两个敲低组细胞M2型分子标志物的表达水平：CD206基因（0.55±0.13）和（0.91±0.11），Arg-1基因（0.74±0.15）和（0.80±0.18），CCL22基因（0.71±0.05）和（0.77±0.04），TGF-β基因（0.63±0.10）和（0.74±0.11），IL-10基因（0.62±0.09）和（0.78±0.12），与si-nc转染组细胞M1和M2型分子标志物的表达水平相比明显降低，结果均具有统计学意义（P<0.05）（Fig.7C）。这些结果说明，在M2型巨噬细胞中敲低NR_19861基因，M2型分子标志物表达降低，M1型分子标志物表达升高，细胞向M1表型发生极化。8.敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清中细胞因子的表达水平ELISA方法检测敲低NR_109861的M2型巨噬细胞培养上清中细胞因子的表达水平。结果显示，在M2型巨噬细胞中，敲低NR_109861基因表达，si-1组和si-2转染组细胞培养上清中IL-12（pg/ml）的表达水平分别是（805.11±212.12）和（530.10±176.81），与si-nc转染组IL-12的表达水平（227.51±31.82）相比明显升高，两组培养上清中TNF-α（ng/ml）的表达水平分别为（72.97±9.38）和（48.47±11.13），与si-nc转染组TNF-α的表达水平（41.92±11.91）相比明显升高，结果均具有统计学意义（P<0.05）（Fig.8A）；si-1和si-2转染组细胞培养上清中IL-10（pg/ml）的表达水平分别是（36.57±4.86）和（45.04±14.08），与si-nc转染组IL-10的表达水平（72.02±7.11）相比明显降低；si-1和si-2转染组细胞培养上清中TGF-β（ng/ml）的表达水平分别为（469.15±77.78）和（554.23±127.31），与si-nc转染组TGF-β的表达水平（869.12±148.52）相比明显升高，结果均具有统计学意义（P<0.05）（Fig.8B）。这些结果提示，敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞的培养上清中，M1型细胞因子IL-12和TNF-α表达升高，而M2型细胞因子IL-10和TGF-β表达降低，说明细胞向M1表型发生极化。9.30%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞上清抑制胃癌细胞的增殖功能MTS方法检测30%敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞上清对胃癌细胞增殖作用的影响。结果显示，在与胃癌细胞AGS的共培养体系中，95 研究论文si-1和si-2转染组细胞24h和48h的OD值分别为：si-1转染组（0.47±0.04）和（0.55±0.04），si-2转染组（0.42±0.03）和（0.50±0.01）与si-nc转染组（0.55±0.07）和（0.62±0.03）相比明显降低；在胃癌细胞BGC-823的共培养体系中，si-1和si-2转染组细胞24h和48h的OD值分别为：si-1转染组（0.38±0.03）和（0.42±0.04），si-2转染组（0.41±0.04）和（0.45±0.03）与si-nc转染组（0.43±0.05）和（0.49±0.08）相比也明显降低，结果均具有统计学意义（P<0.05）（Fig.9A-9B）。这些结果说明，用30%敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞上清作用于胃癌细胞AGS和BGC-823，可抑制其的增殖能力。10.敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞抑制胃癌细胞的迁移能力Transwell方法检测，敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞对胃癌细胞迁移能力的影响。结果显示，M2细胞与胃癌细胞AGS的共培养体系中，每高倍视野下si-1和si-2转染组胃癌细胞平均数分别为：（37.67±6.66）和（42.52±6.36），与si-nc转染组（58.12±3.61）相比明显减少；在M2细胞与胃癌细胞BGC-823的共培养体系中，每高倍视野下si-1和si-2转染组胃癌细胞平均数分别为：（43.33±4.51）和（49.52±3.54），与si-nc转染组（71.67±6.55）相比明显减少，结果具有统计学意义（P<0.05）（Fig.10A-10B）。结果说明，胃癌细胞AGS和BGC-823与敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞共培养，可抑制胃癌细胞的迁移能力。11.30%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清抑制胃癌细胞的迁移能力Transwell方法检测30%敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞的培养上清对胃癌细胞迁移能力的影响。30%M2细胞培养上清与胃癌细胞AGS的共培养体系中，每高倍视野下si-1和si-2转染组胃癌细胞平均数分别为：（37.24±1.42）和（42.58±8.35），与si-nc转染组（58.52±4.95）相比明显减少；30%M2细胞培养上清与胃癌细胞BGC-823的共培养体系中，每高倍视野下si-1和si-2转染组胃癌细胞平均数分别为：（42.34±4.94）和（49.56±3.54），与si-nc转染组（67.51±7.07）相比明显减少，结果具有统计学意义（P<0.05）（Fig.10C-10D）。以上结果说明，胃癌细胞AGS和BGC-823与30%敲低NR_109861基因的M2细胞上清共培养，也可抑制胃癌细胞AGS和BGC-823的迁移能力。96 研究论文附图图1M0、M1和M2细胞的诱导及形态变化Fig.1Inductionandmorphologyofmacrophageswithvarioustypes97 研究论文图2M0、M1和M2型巨噬细胞分子标志物的表达水平Fig.2Expressionofmarkersonmacrophageswithvarioustypes.(A)M1markersand(B)M2markerswereanalyzedbyRT-qPCRandRT-PCR,P<0.05vsM0.(C)CD86/CCR7and(D)CD206/CD163wereanalyzedbyFCM,*P<0.05vs.M0.图3M0、M1和M2型巨噬细胞培养上清中细胞因子的表达水平Fig.3Expressionofcytokinesintheculturalsupernatantfromdifferentmacrophages.Theexpressionof(A)IL-12(B)TNF-α(C)IL-10(D)TGF-βweredetectedbyELISA,*P<0.05vs.M0.98 研究论文图4NR_109881基因在M2型巨噬细胞中高表达Fig.4NR_109861washighlyexpressedinM2macrophages.(A)Heatmap,M2vsM0(B)SchemaofNR_109861(C)ExpressionofNR_109861invarioustissues(datafromNONCODE).99 研究论文图5NR_109861基因在外周血PBMC诱导的M2型巨噬细胞中的表达Fig.5ExpressionofNR_109861inM2macrophagesderivedfromPBMC.(A)ThemorphologyofM2macrophageswereobservedbyinvertedmicroscope(B)RT-qPCRassayshowedtheexpressionofNR_109861wasupregulatedinM2macrophagesderivedfromPBMC-HDandPBMC-GC,*P<0.05vs.PBMC-HD,*P>0.05vs.M2macrophagesderivedfromPBMC-GC,HD:healthydonors,GC:gastriccancerpatients.15P<0.05105(NormalizedtoGAPDH)0Non-cancerGastriccancerTAMRelativeNR_109861expressionlevel图6NR_109861基因在胃癌组织TAM和相应正常组织TAM中的表达Fig.6ExpressionofNR_109861inTAMfromnon-cancertissuesandgastriccancertissues,*P<0.05vs.TAMfromNon-cancertissues.100 研究论文图7敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞中分子标志物的表达水平Fig.7ExpressionofM1andM2markersinM2macrophageswithNR_109861knockingdown.(A)LowexpressionofNR_109861inM2macrophages.(B)M1markerswereincreasedand(C)M2markersweredecreasedinM2macrophageswithNR_109861knockingdown,*P<0.05vs.si-ncgroup.101 研究论文图8敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞培养上清中细胞因子表达Fig.8ExpressionofcytokinesinsupernatantofM2macrophageswithNR_109861knockingdown.(A)IL-12andTNF-α(B)IL-10andTGF-β,*P<0.05vs.si-ncgroup.图930%敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞上清抑制胃癌细胞的增殖Fig.9Effectof30%supernatantofM2macrophageswithNR_109861knockingdownonproliferationof(A)AGSand(B)BGC-823cellsweredetectedbyMTS.Dataarepresentedasmean±SDoftriplicatesamples.*P<0.05vs.si-ncgroup.102 研究论文图10敲低NR_109861的M2型巨噬细胞抑制胃癌细胞的迁移能力Fig.10EffectofM2withNR_109861knockingdownonmigrationofGCcellsweredetectedbytranswellmigrationassays(A-B)．*P<0.05,vs.si-ncgroup.图11敲低NR_109861基因表达的M2型巨噬细胞培养上清抑制胃癌细胞的迁移能力Fig.11Effectof30%supernatantofM2withNR_109861knockingdownonmigrationofGCcellsweredetectedbytranswellmigrationassays(A-B)．*P<0.05,vs.si-ncgroup.103 研究论文附表表1根据基因芯片分析选择15条差异表达的lncRNA进行RT-qPCR验证的实验结果Table1The15lncRNAsfromtheresultsofmicroarraywereanalyzedbyRT-qPCR编号基因名称芯片趋势芯片倍数qPCR倍数1lnc-AL139008.2-3:2up16.0111.712lnc-CLEC7A-2:1up8.610.883ENST00000562942up36.8933.674lnc-AL139008.2-3:3up18.4823.595ENST00000540392up13.897.896ENST00000602461up2.0122.117ENST00000424435up2.291.328NR_109861up7.8511.089lnc-GNLY-2:6down6.23713.5210lnc-CLDN20-1:1down10.759.8311NONHSAT101069down6.4191.9112NR_024607down2.112.3213lnc-PTTG1-1:2down2.561.314lnc-EIF2AK4-7:1down4.1873.7515lnc-IL1A-3:1down2.021.64104 研究论文讨论TAMs对肿瘤的发生发展有着极其重要的影响，几乎覆盖了肿瘤从形成到转移的各个环节。首先，TAM通过分泌大量炎症抑制因子，使机体处于免疫抑制状态，有利于肿瘤的生长。其次，TAM可参与肿瘤相关的血管发生和淋巴管发生。TAMs可表达大量VEGF、IL-8、IL-1等促进血管发生的递质，不但促进血管形成，并且促进了肿瘤沿血管、淋巴管转移。2017年，Song等在CancerCell上发表文章表明，间质样肿瘤细胞和巨噬[6]细胞间的正反馈环路，对乳腺癌细胞的转移至关重要。综合文献研究发现，在胃癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肝癌等恶性肿瘤的发生[7-13]发展中，TAMs均发挥了重要的作用。总之，在肿瘤微环境中，TAM可发生极化，从而对肿瘤细胞的生物学行为产生影响，并决定肿瘤的转归。近年来，越来越多的研究表明，lncRNA在生物学过程中发挥重要的作用，如免疫反应、肿瘤形成、细胞进展和代谢等。一些证据也表明lncRNA[14-16]可作为很多疾病的诊断标志物和治疗靶点。那么，lncRNA能否作为一个重要的调节因子，调控巨噬细胞的极化过程还不十分清楚。本研究首先利用THP-1细胞构建M0、M1和M2型巨噬细胞，并通过RT-qPCR、FCM和ELISA等方法验证其诱导成功。随后，利用基因芯片杂交技术对M0、M1和M2型巨噬细胞的差异lncRNA进行筛选，通过对比M0与M2型巨噬细胞的结果，获得了945条差异表达的lncRNA，其中有719条表达上调，226条表达下调。我们选择8条表达上调和7条表达下调的lncRNA，用RT-qPCR方法在THP-1诱导的M2型巨噬细胞中进行验证，结果显示，所验证的lncRNA的表达趋势与基因芯片分析结果相符，提示芯片筛选结果比较可靠。根据基因芯片结果结合数据库分析，考虑差异基因的表达倍数、表达稳定性、基因长度和组织表达水平等因素，我们发现lncRNA-NR_109861基因是一条位于20p12.2、长度为808bp的长链非编码RNA，其在人的结肠、肝脏、肾脏组织以及外周血白细胞中无表达，且在淋巴结中表达量极低。通过RT-qPCR方法结果分析，与基因芯片结果一致，NR_109861基因在M2细胞中的表达水平显著升高，约是M0细胞表达水平的11倍。所以，我们选择lncRNA-NR_109861基因进行深入研究。首先分离健康献105 研究论文血者和胃癌患者外周血中的PBMC细胞，并诱导成为M2型巨噬细胞，用RT-qPCR方法检测其NR_109861基因的表达水平，结果显示，与PBMC细胞相比，NR_109861基因在PBMC来源的M2型巨噬细胞中表达上调，并且胃癌患者PBMC和健康献血者PBMC来源的M2细胞，其NR_109861基因的表达水平无差异。然后，分离胃癌组织TAM和相应正常胃组织中的TAM，用RT-qPCR方法检测其NR_109861基因的表达水平，结果显示，与相应正常组织TAM相比，NR_109861基因在胃癌组织TAM中表达上调，这些结果均具有统计学意义。综上所述，NR_109861基因在M2型巨噬细胞中表达上调，可能参与巨噬细胞的极化过程。接下来，在M2型巨噬细胞中敲低NR_109861基因表达，经过RT-qPCR方法检测发现，M2型巨噬细胞中M2型分子标志物表达降低，而M1型分子标志物表达升高。ELISA方法分析发现，敲低NR_109861基因的巨噬细胞培养上清中，M1型细胞因子IL-12和TNF-α表达升高，而M2型细胞因子IL-10和TGF-β表达下降。这些结果均表明，NR_109861基因可影响巨噬细胞极化作用，敲低其表达，可诱导巨噬细胞向M1表型发生极化。最后，检测了敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞或者其培养上清，对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。结果发现，敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞可抑制胃癌细胞的迁移能力，而且敲低NR_10961基因的M2型巨噬细胞的培养上清与胃癌细胞共培养，可抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。这些结果均表明，NR_109861基因在TAM极化过程中发挥重要作用。最后，在体外模拟的胃癌微环境中，敲低TAM中NR_109861基因的表达水平，可抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力，抑制胃癌的进展。但其具体机制需要进一步的实验研究。综上所述，lncRNA-NR_109861基因可促进TAM向M2型巨噬细胞方向发生极化，并促进胃癌的发生发展。了解lncRNA-NR_109861基因在TAM中的表达水平及功能机制，将对临床胃癌靶向治疗提供新的方向和思路。小结利用THP-1细胞成功构建M0、M1和M2型巨噬细胞模型，运用芯106 研究论文片杂交技术分析结果显示，LncRNA-NR_109861基因在M2型巨噬细胞中表达升高。进一步检测发现，NR_109861基因在PBMC诱导的M2型巨噬细胞，以及胃癌组织TAM中表达水平均升高。在M2型巨噬细胞中敲低NR_109861基因，可降低M2型分子标志物的表达水平，增加M1型分子标志物的表达水平。敲低NR_109861基因的M2型巨噬细胞培养上清中，促炎因子IL-12和TNF-α表达升高，而炎症抑制因子IL-10和TGF-β表达降低。在胃癌微环境中，即M2型巨噬细胞或者其培养上清与胃癌细胞的共培养体系中，敲低M2细胞NR_109861基因的表达水平，可抑制胃癌细胞的增殖和迁移功能。说明，lncRNA-NR_109861基因可影响巨噬细胞的极化过程，敲低M2细胞NR_109861基因的表达水平，可诱导M2细胞向M1细胞发生极化，从而抑制胃癌的进展。参考文献1.RutkowskiMR,SvoronosN,Perales-PuchaltA,etal.TheTumorMacroenvironment:Cancer-PromotingNetworksBeyondTumorBeds[J].AdvCancerRes,2015,128(1):235-262.2.MantovaniA,SchioppaT,PortaC,etal.Roleoftumor-associatedmacrophagesintumorprogressionandinvasion[J].CancerMetastasisRev,2006,25(3):315-322.3.SolinasG,GermanoG,MantovaniA,etal.Tumor-associatedmacrophages(TAM)asmajorplayersofthecancer-relatedinflammation[J].JLeukocBiol,2009,86(5):1065-1073.4.FlynnRA,ChangHY.LongNoncodingRNAsinCell-FateProgrammingandReprogramming[J].CellStemCell,2014,14(6):752-761.5.SchmittAM,ChangHY.LongNoncodingRNAsinCancerPathways[J].Cancercell,2016,29(4):452-463.6.SuSC,LiuQ,ChenJQ,etal.APositiveFeedbackLoopbetweenMesenchymal-likeCancerCellsandMacrophagesIsEssentialtoBreastCancerMetastasis[J].Cancercell,2014,25(5):605-620.7.BadawiMA,AbouelfadlDM,El-SharkawySL,etal.Tumor-Associated107 研究论文Macrophage(TAM)andAngiogenesisinHumanColonCarcinoma[J].OpenAccessMacedJMedSci,2015,3(2):209-214.8.HaradaK,DongX,EstrellaJS,etal.Tumor-associatedmacrophageinfiltrationishighlyassociatedwithPD-L1expressioningastricadenocarcinoma[J].Gastriccancer,2018,21(1):31-40.9.IshigamiS,NatsugoeS,TokudaK,etal.Tumor-associatedmacrophage(TAM)infiltrationingastriccancer[J].AnticancerRes,2003,23(5A):4079-4083.10.LiuB,JiaY,MaJ,etal.Tumor-associatedmacrophage-derivedCCL20enhancesthegrowthandmetastasisofpancreaticcancer[J].ActaBiochimBiophysSin,2016,48(12):1067-1074.11.ShenR,WangY,WangCX,etal.MiRNA-155mediatesTAMresistancebymodulatingSOCS6-STAT3signallingpathwayinbreastcancer[J].AmJTranslRes,2015,7(10):2115-2126.12.ShigeokaM,UrakawaN,NakamuraT,etal.TumorassociatedmacrophageexpressingCD204isassociatedwithtumoraggressivenessofesophagealsquamouscellcarcinoma[J].CancerSci,2013,104(8):1112-1119.13.ZhuF,LiX,ChenS,etal.Tumor-associatedmacrophageorchemokineligandCCL17positivelyregulatesthetumorigenesisofhepatocellularcarcinoma[J].MedOncol,2016,33(2):17.14.BachDH,LeeSK.LongnoncodingRNAsincancercells[J].Cancerletters,2018,419(1):152-166.15.HuoX,HanS,WuG,etal.DysregulatedlongnoncodingRNAs(lncRNAs)inhepatocellularcarcinoma:implicationsfortumorigenesis,diseaseprogression,andlivercancerstemcells[J].MolCancer,2017,16(1):165.16.SunM,GadadSS,KimDS,etal.Discovery,Annotation,andFunctionalAnalysisofLongNoncodingRNAsControllingCell-CycleGeneExpressionandProliferationinBreastCancerCells[J].MolCell,2015,59(4):698-711.108 研究论文结论在本研究中，我们首先发现非编码RNA-snord105b基因在胃癌组织、胃癌患者血清和胃癌细胞系中表达升高，snord105b基因在胃癌组织中的表达水平，与患者肿瘤大小、分化程度和TNM分期呈正相关。在胃癌细胞中，snord105b作为一种癌基因，促进胃癌的增殖、迁移和侵袭功能。敲低snord105b基因，促进胃癌细胞的早期凋亡，减少细胞周期S期，发生G0/G1期阻滞，减慢胃癌的进展。RNA-ChIRP实验表明，snord105b基因可能通过与ALDOA蛋白相互作用，影响致癌因子C-myc蛋白的表达水平，导致胃癌细胞发生EMT，最终促进胃癌的发生发展。其次，我们利用THP-1细胞成功构建了M0、M1和M2型巨噬细胞模型，基因芯片分析结果结合RT-qPCR验证发现，非编码lncRNA-NR_109861基因在M2型巨噬细胞中表达升高。NR_109861基因影响巨噬细胞的极化过程，敲低NR_109861基因，可使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞方向发生极化，并抑制体内外胃癌细胞的增殖和迁移能力，减慢胃癌进展。109 综述综述非编码snoRNA结构与功能的研究进展长久以来，科研工作者关于基因表达的研究集中在编码蛋白质的mRNA上，取得了巨大的成绩，奠定了恶性肿瘤靶向治疗所依据的科学基[1]础。新的RNA检测技术，如深度测序和基因芯片分析表明大于50%的人类基因组被转录为RNA，而只有小于2％的基因编码蛋白质。因此，非[2,3]蛋白质编码RNA是基因表达最丰富的形式。非编码RNA（ncRNA）是近年来发现的一类能转录但不编码蛋白质且具有特定功能的RNA小分子，其主要功能有：参与mRNA的稳定和翻译水平的调节、参与蛋白质[4-6]的运输、参与RNA的加工和修饰、影响染色体的结构等。非编码RNA种类繁多，主要有核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（microRNA）、核仁小RNA（snoRNA）和环状RNA（circRNA）等。本文我们选择非编码RNA-snoRNA及其衍生物sdRNA，对其结构和功能的研究进展进行深入阐述。1非编码RNA的形成RNA前体的加工导致非编码RNA家族数量的增加，例如microRNA、lncRNA、snoRNA、snRNA、circRNA和piRNA等。所有这些RNAs均来自较长的前体，通过20多种RNA酶的作用，形成不同类型的RNA。这些RNA酶是多样的，包括作用于单链RNA的核酸内切酶和核酸外切酶，[7]以及切割双链的核糖核酸酶。成熟的非编码RNA通过多种机制逃避酶促降解。首先，其末端可形成双链RNA结构，可保护单链RNA来自核酸外切酶的剪切；第二，碱基修饰，例如2'-O-甲基化和假尿苷化，可降低snoRNA对RNA酶的敏感性；此外，通过加帽修饰，腺苷酸化或尿苷酸化防护核酸外切酶的作用。最常见的是形式是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，保护RNA以防核酸酶作用。较长的RNA前体的片段化不是随机的，对裂解部位的选择性主要通过三大途径实现：第一，引导RNAs，如snoRNAs标记剪切部位，在核糖体RNAs最为显著。第二，形成二级结构，最适合用于miRNAs，其中RNA110 综述的双链区决定了Drosha/DGCR8复合物的切割位点。第三，蛋白质可以[8,9]标记剪切位点。蛋白质可通过保护RNA免受核酸外切酶作用，或是通过标记核酸内切酶的位点，例如DGCR8，对RNA进行切割，形成新的[10]RNA片段。通过各种酶的切割作用，使较长的RNA前体，形成不同的非编码RNA片段，再根据不同核苷酸和蛋白质的保护机制，使这些非编码RNA片段稳定存在并发挥生物学功能。2经典的snoRNA：典型的功能性核糖核酸复合物（RNP）核仁小RNA（snoRNA）是一类主要聚集于细胞核仁区，长度在60-300nt的长链非编码RNA，其代谢稳定，且在多种组织和细胞中广泛存在，是含量最丰富的非编码RNA。SnoRNAs主要功能是参与核糖体RNA及剪接体RNA的转录后修饰，这些转录后修饰对生成有效和精准的核糖体具有重要意义。SnoRNAs和其相关蛋白在进化过程中高度保守，而且通[11,12]常由内含子区域编码。基于snoRNA保守的特征性序列，snoRNA可分为C/DboxsnoRNA和H/ACAboxsnoRNA。C/DboxsnoRNA含有Cbox（RUGAUGA，R=嘌呤）和Dbox（CUGA）box，以及重复的C'和D'box，可以产生一个独特的二级结构，可与rRNA中长度约10-20nt的保守核心序列结合，参与核糖体的形成加工过程。H/ACAboxsnoRNA含有两个茎，形成一个假尿苷化口袋和两个单链的含有保守的H（ANANNA）和ACA元件的结构域[12,13]。SnoRNA结构如图1所示：图1snoRNA的结构示意图111 综述SnoRNA与一些蛋白质结合，形成核仁小核糖核蛋白（snoRNP），能在血浆中稳定存在且避免被降解。SnoRNPs是具有酶活性的蛋白质，可参与多种RNA的加工修饰，包括非编码RNA，例如rRNA，snRNAs和古生菌的tRNA，甚至mRNA。C/DboxsnoRNA与一些蛋白，例如非组蛋白染色体蛋白2-1类（NHP2L1）、核仁蛋白5A（NOP56）、核仁蛋白5（NOP58）和纤维蛋白（fibrillarin）等结合，形成C/DboxsnoRNP，其可促进RNA靶部位的2'-O-甲基化。H/ACAboxsnoRNA也可与一些蛋白，例如dyskerin/Cbf5、Gar1、Nhp2和Nop10等结合，形成H/ACAboxsnoRNPs，其可以催化尿苷向假尿苷转化，促进RNA靶部位的假尿苷化修饰。在snoRNP复合物中，snoRNAs的功能是双重的：RNA形成了一个支架，有利于RNP复合物的组装，以及引导靶RNA不同核苷酸的酶活性，识别[14]snoRNA特异性部位进行杂交。此外，有研究报道snoRNA非经典作用之外的新功能：参与真核生物RNAs成熟过程中的3’-末端加工。通过pull-down实验结合高通量测序分析发现，SNORD50A参与调控mRNA3’-末[15]端的加工。综上所述，经典的snoRNA大体分为两种类型，即C/DboxsnoRNA和H/ACAboxsnoRNA，具有广泛的生物学功能，其主要作用是对rRNA、snRNA等进行2’-O-甲基化或者假尿苷化修饰，促进核糖体的形成和加工过程。3SnoRNA在人类肿瘤中的作用SnoRNAs首次发现于20世纪60年代，在随后的50年中，snoRNA被认为广泛作用于其他RNA的成熟过程以及各种生物过程中。目前我国每年癌症新发病例约为220万，因癌症死亡人数约为160万，现有病例约310万。近20年来，中国癌症死亡率上升了29.42%，造成重大的经济负[16]担，是严重危害人类健康的疾病之一。从本质上说，癌症是一种多种因素影响的、细胞信息改变的、细胞稳态破坏的、并能促进细胞生长的遗传性疾病。影响正常细胞向癌细胞转化的过程之一是核糖体成熟和功能缺陷。核糖体RNA生物合成在癌症发生的作用远比正常细胞重要。由于snoRNA参与核糖体RNA加工与修饰的调节，因此我们认为其可能也参与肿瘤的发生。近年来，越来越多的研究发现snoRNA参与前列腺癌、乳腺癌、肺[17]癌、肝癌、肾癌、结肠癌等多种癌症的发生。112 综述2002年，Chang等人首次证明snoRNAs参与肿瘤的发生。他们发现H/ACA家族的snoRNA-h5sn2在正常大脑组织高表达，但是在发生脑膜[18]瘤时表达降低。说明，缺乏snoRNA-h5sn2参与脑肿瘤的进展。2014年Xu等人发现在肝细胞肝癌中，SNORD113-1基因的表达降低与肿瘤的分[19]期、进展和患者的生存相关。在2008-2009年，Dong等在两篇研究中报道，snordRNAU50基因是一种肿瘤抑制基因，其在前列腺癌和乳腺癌细胞中表达降低，乳腺癌患者外周血中表达下调。在前列腺癌和乳腺癌细[20,胞中转入U50基因，可抑制癌细胞克隆的形成，抑制肿瘤的形成发展21]。以上结果说明，snoRNA可作为一种抑癌基因，参与脑瘤、肝癌、前列腺癌和乳腺癌的发生发展。非小细胞肺癌位于全球癌症死因的首位，有研究表明snoRNA参与非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer，NSCLC)的进展。2010年，Liao等人首次进行人类肿瘤组织snoRNA表达谱分析。结果显示，与正常组织相比，肺癌组织中高表达一系列snoRNAs，且SNORA42基因的表达水平显著升高。在这篇研究中，他们提出通过RT-qPCR技术检测血浆snoRNAs，[22]可作为一种NSCLC的潜在诊断方法。2012年，Mei等研究发现，SNORA42基因具有癌基因的活性，其在NSCLC组织中高表达，且表达水平与患者预后明显负相关，提高癌细胞内SNORA42基因的表达水平则明显增强细胞的增殖能力和克隆形成；相反，降低癌细胞内SNORA42基因的表达将诱导细胞凋亡、降低克隆形成能力和减少动物体内移植瘤的形[23]成。2015年，zheng等人发现在NSCLC组织中snord78基因的表达升高。在该研究中，沉默snord78基因通过诱导G0/G1期阻滞和细胞凋亡抑[24]制细胞增殖。2017年Gut杂志报道SNORA42基因作为癌基因在结肠[25]癌中高表达，可作为肿瘤标志物用于临床结肠癌的诊断和复发。有报道称，SNORA21基因在结肠癌组织中表达升高，可作为结肠癌预后不良的[26]独立诊断因素。此外，snord126基因在结肠癌组织和肝癌组织中表达上调，可作为其潜在的治疗靶标。在结肠癌细胞和肝癌细胞中，snord126基因可通过激活PI3K/AKT信号通路促进两种癌细胞的生长，而敲低[27]snord126基因可通过抑制AKT的磷酸化而阻碍肿瘤的生长。另外还有研究发现，SNORD76基因在肝癌组织中表达升高且与患者不良预后相关，[28]降低SNORD76基因的表达，可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能。113 综述综上结果表明，snoRNAs可作为癌基因在多种肿瘤，包括非小细胞肺癌、结肠癌和肝癌中表达升高，促进肿瘤进展。SnoRNA表达谱可用于某些血液病的诊断。2012年，Blood研究报道，[29]snoRNAs可作为T细胞淋巴瘤的诊断标志物。2017年，nature子刊报道，急性髓细胞白血病患者发生一些列C/DboxsnoRNAs的表达水平的[30]改变，且与体内白血病干细胞的数量紧密相关。总之，这些发现说明，C/DboxsnoRNA/RNP组成的通路在白血病发生中具有重要作用，也可作为标志物用于白血病的早期诊断。综上所述，snoRNAs在癌症中发挥重要功能，与miRNA类似，根据不同肿瘤组织类型以及snoRNAs种类，snoRNA既可发挥抑癌基因的作用，也可以作为癌基因参与肿瘤的发生发展。4小卡哈尔RNA和孤儿snoRNA显示了非经典snoRNA的功能小卡哈尔RNA（smallCajalRNA，scaRNA）和孤儿RNA（orphan[31]snoRNA）是snoRNA中比较少见的类型。一些snoRNA定位于细胞核内的卡哈尔体（Cajalbody，CB），其是一种参与RNA代谢、snRNP和[32]snoRNP生物合成的亚单位，因此被定义为scaRNA。ScaRNA的共同特征是卡哈尔体的定位信号CAB-box（基序UGAG），其确保卡哈尔体的积累。迄今为止，只有scaRNAU85证实在U5剪接体RNA的2'-O-核糖甲[33]基化和假尿苷化中起作用。另一种非典型的不参与RNA甲基化或假尿苷化的scaRNA是端粒酶RNA组分（TERC）。TERC通过发挥端粒酶活性作为端粒合成的模板，从而确保基因组的完整性。CABbox和TERC的3'-H/ACA结构域被认为有助于纠正前体RNA的定位和加工，以及端粒酶[34]RNP的组装。SnoRNA保守的整体结构可以识别其靶RNA。然而，通过分子生物学和生物信息学技术发现了许多没有靶RNA的snoRNA，被称为“孤儿snoRNA”。尽管缺乏与其反义链结合的RNA序列，这些snoRNA仍具有生理作用。例如孤儿snoRNA-SNORD114-1在肿瘤细胞中表达失调，通过[35]促进细胞周期G0/G1期向S期转化，促进急性淋巴瘤的进展。此外，另一个C/DboxsnoRNA，SNORD115（HBII-52）表现出和5-羟色胺受体[36]2C前体mRNA的序列互补性，并影响该前体mRNA的选择性剪接。5SnoRNA衍生的RNA（snoRNAderivedRNA,dsRNA）114 综述在最初设计用于分析miRNA表达谱的实验中，来源于snoRNAs和tRNA的阅读框只占总体数据的一小部分。因此，sdRNA和tRF经常被忽略为成熟snoRNA和tRNA的人为序列或者降解片段。但是，有针对性地比较分析这些小RNA群体，并再次分析现有测序数据发现，sdRNA和tRF在相关物种进化中是保守的，且广泛存在于真核生物中。所以，我们认为snoRNA可能产生一类不同的、且具有新的生物学功能的非编码RNA片段。H/ACAboxsnoRNA产生长度为17-19nt的RNA。C/DboxsnoRNA产生长于27nt的片段。这种长度分布认为大部分C/DboxsnoRNA片段不同于中等长度21-22nt的miRNA。最近有研究报道称通过全面的生物信息学分析表明，大约一半的C/DboxsnoRNA产生较短的片段。这些片段大部分含有C和D盒，并在多种细胞系中保守，表明它们不是随机降解[37,38]的结果。SnoRNA片段被命名为加工的snoRNAs（psnoRNAs）或snoRNA衍生的RNA（sdRNA）。人们建议用psnoRNA描述snoRNA衍生的长度大于22ntRNA，而使用sdRNA描述psnoRNA和snoRNA衍生的miRNA。6sdRNA与相关蛋白形成RNP典型的C/D和H/ACAboxsnoRNA与一组明确的蛋白相结合，形成成熟的snoRNP。人们用U3来研究snoRNP形成的机制，其是在前体rRNA加工过程中发挥作用，不由内含子编码，并具有自己的启动子的一个C/DboxsnoRNA。至少有两个蛋白质复合物与U3-snoRNA成熟过程相关。复合物含有核心C/DboxsnoRNP蛋白15.5kD，Nop56/58和纤维蛋白。其他蛋白质在snoRNP组装（TIP48、TIP49和Nopp140），RNA处理（TGS1、[39]La、Lsm4和Rrp46）和RNA定位（CRM1和PHAX）中的发挥作用。这些研究结果表明，非经典的蛋白质与snoRNAs成熟过程中相关。来自SNORD115（MBII-52）基因群的sdRNA的蛋白质组成是通过使用寡核苷酸从可溶性核提取物的下拉实验进行分析捕获。RNA相关蛋白参与不同的信号通路，例如：mRNA前体剪接（hnRNPA1、A2/B1、A3、D0、Matrin-3和ELAV样蛋白I），转录调控（puralpha、purbeta、依赖ATP的RNA解旋酶A和TDP-43）和染色质组织（CentromereproteinV和nucleolin）。这些实验表明大多数SNORD115RNA形成新的RNP。但是，这些实验不能排除SNORD115RNAs的一部分与经典的C/Dbox115 综述snoRNA蛋白（纤维蛋白、NOP56/58和15.5kD）相关，其可能没有在[40,41]寡核苷酸下拉中被捕获。综上所述，这些说明来源于SNORD115基因簇的RNA与多种RNA结合蛋白相关。有可能RNA形式既是经典的，含有纤维蛋白的RNP和含有复合物的新hnRNP。总之，证据显示sdRNA可以形成不同于经典snoRNAs的核糖核蛋白复合物。7sdRNA的形成snoRNAs如何产生更短的RNA仍然在很大程度上是未知的。最好的理解是从snoRNAs形成miRNA。大多数哺乳动物的miRNA是由pri-miRNA经Drosha/DGCR8酶进行核切割产生的，pre-miRNA运送到胞浆后，被DICER酶切割成为成熟的miRNA，负载于argonautes蛋白。H/ACAboxsnoRNAACA45产生的miRNA证明了snoRNA产生的miRNA对[42]DICER酶的依赖性。C/DboxsnoRNAs的情况是不同的。深度测序显示野生型细胞和[43]DICER/DGCR8基因敲除细胞之间的长度分布是没有差异的。原生动物模型生物体Gardialamblia研究表明，DICER参与snoRNA生成miRNA的过程。在Gardialamblia中发现的25个snoRNA中有12个产生较小（约30nt长）的RNAs，其中6个是Ago相关的。Gardialamblia没有DROSHA/DGCR8同源物和运输蛋白5，但有功能类似于Dicer（GlDcr）和Argonate（GlAgo）的蛋白同系物。在Gardialamblia中，一条snoRNA产生的较小片段是GlsR2，其类似于酵母和脊椎动物的U14snoRNA。体外和体内实验显示，GlsR2snoRNA被未知的因子加工成中间的RNA（pre-miR5），再形成microRNA-miR5。miR5负载于GardialambliaGlAgo蛋白，并作为miRNA发挥功能的功能。这表明由C/DboxsnoRNA产生的miRNA具有部分，但不是全部经典miRNA的形成特征。由于Gardialamblia是早期的真核生物，snoRNAs可能是一种进化保守的miRNA来[44,45]源。深度测序检测所有与DGCR8相交联的细胞内RNA发现，snoRNA可与DGCR8相结合，表明通过一种新型的DGCR8依赖途径，可以产生一些psnoRNA。重要的是，这些snoRNAs是依赖于DGCR8，而不是drosha，这表明DGCR8与其他RNA酶相互作用产生psnoRNA。DGCR8的敲低116 综述增加了成熟的snoRNA，但并不影响pre-snoRNA的丰度。这表明DGCR8[46]作用于一些成熟的snoRNAs而不是snoRNAs前体。SdRNA是由经典的snoRNA或sdRNA的宿主内含子产生。在酵母中C/DboxsnoRNA核心蛋白NOP58的敲除，导致snoRNA前体的积累。U3成熟表明这些前体与各种RNA结合蛋白相关，这些蛋白有助于sdRNAs[47]的形成和随后的稳定。以上数据表明H/ACA和C/DboxsnoRNA可通过各种加工途径产生miRNA和sdRNA。8sdRNA的功能因为snoRNA及其加工片段具有多种功能，所以它们参与人类疾病的发生。（1）sdRNA调控生理应激反应在酵母和人类细胞系的研究中表明，改变经典snoRNA可以通过修饰前体mRNA来改变基因表达。例如，C/DboxsnoRNA的反义链可以被修饰，并靶向邻近分支点前体mRNA的区域，引起分支点腺苷的2'-O-甲基[48]化，并减少对下游3'剪接位点的识别。SdRNA具有一些不同于核糖体加工修饰的新功能。在生理刺激条件下，一些snoRNA单位的表达水平会发生快速改变。例如，C/DboxsnoRNAsSNORD116和SNORD115在大脑学习时，表达水平的改变，但[49]这并不影响核糖体修饰。这些结果表明SNORD116和SNORD115位点可以发挥经典snoRNA功能之外的作用。（2）snoRNAs来源的miRNA调节转录snoRNA片段最好理解的作用机制是作为miRNA的功能。许多miRNA是由snoRNA产生的。在报告基因分析中证实了几种snoRNA衍生的miRNA的功能。有趣的是，一些典型的miRNA位于核仁中，而不是像大多数其他miRNAs存在于细胞浆中。这表明一些snoRNA衍生的[50]miRNAs具有核仁功能。一些snoRNA衍生的miRNA起源于孤儿snoRNA，例如SNORD83A、GlsR17和GlsR16等。这表明一些孤儿snoRNAs可作为miRNA前体的储存形式。此外，几个snoRNAs显示出作用于核糖体RNA产生miRNAs，[51]可能表明这些snoRNA在翻译调控的多个方面起作用。（3）sdRNA调节总基因的表达117 综述典型的C/DboxsnoRNA通过它们10-20nt长的反义盒与靶RNA相互作用。相反，sdRNA可以与靶RNA的其他序列元件相互作用，形成一个不同于经典RNP的蛋白复合物。例如，C/DboxsnoRNASNORD88C（HBII-180C）被加工成更短的片段，并在C’和D’盒之间被称为mRNA互补性M盒的区域与成纤维细胞生长受体-3（FGFR-3）的pre-mRNA表现出互补性。M盒序列活化，导致其以序列依赖的方式改变GFP报告基因表达[52]。这些研究表明snoRNA可通过基于siRNA的基因敲除策略的以外的方式，介导基因表达的改变。（4）sdRNA调控基因的选择性剪切SNORD115（HBII-52）是一种被加工成更短的片段的C/DboxsnoRNA。全长的snoRNA在其反义盒之间具有一段18nt长的，与血清素受体2C前体mRNA外显子选择性互补的序列。使用反义盒序列作为指导，发现另外六个外显子也受到SNORD115的调控，这表明snoRNA可以调节多个转录本。由于SNORD115基因簇产生全长的snoRNAs和sdRNAs，这很难确定哪个是功能性RNA的形式。然而，sdRNAs代谢稳定，与hnRNPs形成复合物，参与选择性剪接的调控，其有可能是参与选择较长RNA的[41]剪接位点。SNORD88C（HBII-180C）基因是另一种经过处理和展现出与前体mRNA的互补性的snoRNA。除了改变报告基因表达，HBII-180C有可能通过其M盒与内含子FGFR-3元件之间的相互作用，表达增加FGFR-3外[37]显子的表达。以上研究结果显示sdRNAs可以通过反义链和M-box元件与前体mRNA的相互作用，来改变基因剪接。（5）sdRNAs在疾病中的作用深度测序、基因扫描、转录和分子分析等研究表明，这些小RNA、小RNA的前体或者基因位点与遗传疾病和恶性肿瘤相关，例如前列腺癌、肺癌、肺癌、乳腺癌、B细胞淋巴瘤和急性白血病，以及与癌症相关的老[3,53]龄化、氧化应激和胚胎发育的过程有关。Prader-Willi综合征是一种染色体缺失导致的基因病，其特征为食欲过盛、激素失衡、身材矮小和轻度精神迟缓。研究发现，表达于15号染色体上的两个孤儿snoRNAsHBII-52和HBII-85是发生Prader-Willi综合征的关键区域。临床研究发现，仅有HBII-85一个微小的缺失则会导致118 综述Prader-Willi综合征，表明sdRNA表达簇的丢失是此病发生的决定性因素[54,55]。p53蛋白是一种肿瘤抑制因子，阻止癌基因发生转变。2015年，Nielsen和他的团队发现P53具有抑制多顺反子C/DboxsnoRNAs家族的功能，这个家族的snoRNAs可以进一步加工成为类似miRNA的RNA片段。这些片段抑制TAF9B介导的p53的稳定性并促进细胞增殖，导致乳腺癌的[56]发生。此外，Patterson等人研究发现，人snoRNA-93也可进一步加工[57]成为一种类似于microRNA的片段促进乳腺癌细胞的侵袭。Martens等人通过针对不同阶段前列腺癌和前列腺正常组织的小非编码RNA的深度测序研究发现，snoRNA片段在癌症组织中表达的重要性。其中，78种sdRNA在前列腺癌中显著高表达，包括SNORD44、SNORD78、SNORD74和SNORD81，其表达程度高于microRNA。大多数sdRNA来源于其前体的等位基因，且每一个前体snoRNA都有一个主要的sdRNA。C/DboxRNASNORD78衍生的sdRNA在进展期前列腺癌中表达显著增[58]加，表明sdRNA可作为前列腺癌诊断和预后的标志物。Patterson等人研究发现，除了snoRNA的经典功能，它们可以加工成为较短的microRNA发挥作用。作者利用RNA芯片技术检测了两种侵袭性不同的乳腺癌细胞系，即高侵袭性的MDA-MB-231和低侵袭性的MCF-7，结果发现在高侵袭性的MDA-MB-231细胞中有13种snoRNA表达明显升高。其中，敲低snoRNA衍生的sdRNA-93可导致MDA-MB-231细胞失去侵袭性，而在低侵袭性的乳腺癌细胞中过表达sdRNA-93可增加其侵袭性。对临床乳腺癌样本的检测进一步证实了这个结果。综上所述，snoRNA衍生的sdRNA-93通过类似microRNA的调控作用，参与乳腺癌[57]细胞恶性表型的调节。Pan等人研究发现，snoRNA衍生的miRNA也可以调节细胞中药物的分布。H/ACASNORA34衍生的has-miRNA-1291可通过结合mRNA-ABCC1（一种调控药物累积和化疗敏感性的膜转运基因）的3’-UTR区并[59]负调节其表达水平，进而调控细胞中药物分布和化疗敏感性。这对临床肿瘤患者药物治疗具有重要意义。综上所述，越来越多的研究指出，在癌症进展的过程中，snoRNA表达发生变化。由于snoRNA的广泛加工，这些snoRNA的衍生物也发挥着119 综述自己独特的生物学作用，对临床肿瘤等遗传性疾病的诊断和治疗具有重要意义。9总结核仁小RNAs最初被发现于细胞核仁区，被认为广泛作用于rRNA。多年来，snoRNA生物学功能的研究揭示其具有不同于RNA修饰的新功能。SnoRNA可能参与代谢压力反应的调节、一些疾病的发生和进展，例如癌症或Prader-Willi综合征。酵母细胞中，在非最佳生长条件下，包括紫外线照射、厌氧生长、高或低pH培养基和无氨基酸或糖培养基等，snoRNA的剪切作用最为突出。因此，这种对环境变化的反应，表明snoRNA的加工在压力依赖性代谢调控中发挥关键作用。此外，更多研究发现大多数成熟的snoRNA进一步加工成稳定且更短的RNA片段，称为sdRNA。这样的碎片存在于许多生物体中，包括哺乳动物、原生动物贾第鞭毛虫、芽殖酵母菌、酿酒酵母和Epstein-Barr病毒。有趣的是，这些片段RNA的相关蛋白不同于全长snoRNAs的结合蛋白，因此可能完成不同的细胞功能。一些snoRNA产生miRNA，而另一些产生较长的RNA，psnoRNA。snoRNA衍生的miRNA可在细胞质中发挥传统的miRNA功能，影响基因翻译过程。这说明snoRNAs通过rRNA加工和翻译两种机制，影响蛋白质合成。通过RNA酶将snoRNA转化为miRNA可能会成为一个新的调控机制。类似于经典的snoRNA，sdRNAs可能作为支架形成蛋白质复合物，也作为一种靶向装置发挥作用。由于sdRNAs具有多种功能，它们可利用不同机制，多方面调控基因表达：基因转录、前体mRNA加工和染色质修饰等。因此，sdRNA可以在基因表达中发挥重要的调控作用。本综述总结了snoRNA及其衍生的RNA的分类、形成、功能及可能的作用机制。作为一种非编码RNA，snoRNA及其衍生物在基因调控中发挥重要作用，并参与肿瘤以及多种疾病的发生发展。snoRNA及其衍生物作为分子靶标，对肿瘤临床靶向治疗提供了新的分子靶点；作为肿瘤标志物对肿瘤的诊断和预后都具有重要的临床意义。120 综述参考文献1.SchmittAM,ChangHY.LongNoncodingRNAsinCancerPathways[J].Cancercell,2016,29(4):452-463.2.PennisiE.Genomics.ENCODEprojectwriteseulogyforjunkDNA[J].Science,2012,337(6):1159-1161.3.FalaleevaM,StammS.ProcessingofsnoRNAsasanewsourceofregulatorynon-codingRNAs:snoRNAfragmentsformanewclassoffunctionalRNAs[J].BioEssays,2013,35(1):46-54.4.FlintoftL.Non-codingRNA:StructureandfunctionforlncRNAs[J].NatRevGenet,2013,14(9):598.5.QuinnJJ,ChangHY.Uniquefeaturesoflongnon-codingRNAbiogenesisandfunction[J].NatRevGenet,2016,17(1):47-62.6.YangY,WenL,ZhuH.Unveilingthehiddenfunctionoflongnon-codingRNAbyidentifyingitsmajorpartner-protein[J].Cell&bioscience,2015,5(1):59.7.TomeckiR,DziembowskiA.NovelendoribonucleasesascentralplayersinvariouspathwaysofeukaryoticRNAmetabolism[J].Rna,2010,16(9):1692-1724.8.ZhuL,LiuX,PuW,etal.tRNA-derivedsmallnon-codingRNAsinhumandisease[J].Cancerletters,2018.9.LeungYY,RyvkinP,UngarLH,etal.CoRAL:predictingnon-codingRNAsfromsmallRNA-sequencingdata[J].NucleicAcidsRes,2013,41(14):e137.10.KrolJ,LoedigeI,FilipowiczW.ThewidespreadregulationofmicroRNAbiogenesis,functionanddecay[J].NatRevGenet,2010,11(9):597-610.11.LanghendriesJL,NicolasE,DoumontG,etal.ThehumanboxC/DsnoRNAsU3andU8arerequiredforpre-rRNAprocessingandtumorigenesis[J].Oncotarget,2016,7(37):59519-59534.12.MateraAG,TernsRM,TernsMP.Non-codingRNAs:lessonsfromthesmallnuclearandsmallnucleolarRNAs[J].NatRevMolCellBiol,2007,121 综述8(3):209-220.13.Kiss-LaszloZ,HenryY,BachellerieJP,etal.Site-specificribosemethylationofpreribosomalRNA:anovelfunctionforsmallnucleolarRNAs[J].Cell,1996,85(7):1077-1088.14.WilliamsGT,FarzanehF.AresnoRNAsandsnoRNAhostgenesnewplayersincancer?[J].NatRevCancer,2012,12(2):84-88.15.ShiJ,HuangC,HuangS,etal.snoRNAsassociatewithmRNA3'processingcomplex:Newwineinoldbottles.[J].RnaBiology,2017,15(2):1-4.16.GuoT,XieL,ZhaoJ,etal.[TrendanalysisofmorbidityandmortalityofcolorectalcancerinChinafrom1988to2009][J].Zhonghuaweichangwaikezazhi=Chinesejournalofgastrointestinalsurgery,2018,21(1):33-40.17.MannoorK,LiaoJ,JiangF.SmallnucleolarRNAsincancer[J].Biochimicaetbiophysicaacta,2012,1826(1):121-128.18.ChangLS,LinSY,LieuAS,etal.Differentialexpressionofhuman5SsnoRNAgenes[J].BiochemBiophysResCommun,2002,299(2):196-200.19.XuG,YangF,DingCL,etal.SmallnucleolarRNA113-1suppressestumorigenesisinhepatocellularcarcinoma[J].MolCancer,2014,13(2):16.20.DongXY,GuoP,BoydJ,etal.ImplicationofsnoRNAU50inhumanbreastcancer[J].JGenetGenomics,2009,36(8):447-454.21.DongXY,RodriguezC,GuoP,etal.SnoRNAU50isacandidatetumor-suppressorgeneat6q14.3withamutationassociatedwithclinicallysignificantprostatecancer[J].HumMolGenet,2008,17(7):1031-1042.22.LiaoJP,YuL,MeiYP,etal.SmallnucleolarRNAsignaturesasbiomarkersfornon-small-celllungcancer[J].MolCancer,2010,9.23.MeiYP,LiaoJP,ShenJ,etal.SmallnucleolarRNA42actsasanoncogeneinlungtumorigenesis[J].Oncogene,2012,31(22):2794-2804.24.ZhengD,ZhangJ,NiJ,etal.SmallnucleolarRNA78promotesthetumorigenesisinnon-smallcelllungcancer[J].JExpClinCancerRes,2015,34(1):49.25.OkugawaY,ToiyamaY,TodenS,etal.ClinicalsignificanceofSNORA42122 综述asanoncogeneandaprognosticbiomarkerincolorectalcancer[J].Gut,2017,66(1):107-117.26.YoshidaK,TodenS,WengW,etal.SNORA21-AnOncogenicSmallNucleolarRNA,withaPrognosticBiomarkerPotentialinHumanColorectalCancer[J].EBioMedicine,2017,22(1):68-77.27.FangX,YangD,LuoH,etal.SNORD126promotesHCCandCRCcellgrowthbyactivatingthePI3K-AKTpathwaythroughFGFR2[J].JMolCellBiol,2017,9(3):243-255.28.WuL,ChangL,WangH,etal.ClinicalsignificanceofC/DboxsmallnucleolarRNAU76asanoncogeneandaprognosticbiomarkerinhepatocellularcarcinoma[J].ClinResHepatolGastroenterol,2018,42(1):82-91.29.ValleronW,YsebaertL,BerquetL,etal.SmallnucleolarRNAexpressionprofilingidentifiespotentialprognosticmarkersinperipheralT-celllymphoma[J].Blood,2012,120(19):3997-4005.30.ZhouF,LiuY,RohdeC,etal.AML1-ETOrequiresenhancedC/DboxsnoRNA/RNPformationtoinduceself-renewalandleukaemia[J].NatcellBio,2017,19(7):844-855.31.BratkovicT,RogeljB.ThemanyfacesofsmallnucleolarRNAs[J].BiochimBiophysActa,2014,1839(6):438-443.32.MachynaM,HeynP,NeugebauerKM.Cajalbodies:whereformmeetsfunction[J].WileyInterdiscipRevRNA,2013,4(1):17-34.33.JadyBE,KissT.AsmallnucleolarguideRNAfunctionsbothin2'-O-ribosemethylationandpseudouridylationoftheU5spliceosomalRNA[J].EMBOJ,2001,20(3):541-551.34.EganED,CollinsK.AnenhancedH/ACARNPassemblymechanismforhumantelomeraseRNA[J].MolCellBiol,2012,32(13):2428-2439.35.ValleronW,LaprevotteE,GautierEF,etal.SpecificsmallnucleolarRNAexpressionprofilesinacuteleukemia[J].Leukemia,2012,26(9):2052-2060.36.KishoreS,KhannaA,ZhangZ,etal.ThesnoRNAMBII-52(SNORD115)123 综述isprocessedintosmallerRNAsandregulatesalternativesplicing[J].HumMolGenet,2010,19(7):1153-1164.37.OnoM,ScottMS,YamadaK,etal.IdentificationofhumanmiRNAprecursorsthatresembleboxC/DsnoRNAs[J].NucleicacidsRes,2011,39(9):3879-3891.38.ScottMS,OnoM,YamadaK,etal.HumanboxC/DsnoRNAprocessingconservationacrossmultiplecelltypes[J].NucleicacidsRes,2012,40(8):3676-3688.39.WatkinsNJ,LemmI,IngelfingerD,etal.AssemblyandmaturationoftheU3snoRNPinthenucleoplasminalargedynamicmultiproteincomplex[J].MolCell,2004,16(5):789-798.40.SoenoY,TayaY,StasykT,etal.Identificationofnovelribonucleo-proteincomplexesfromthebrain-specificsnoRNAMBII-52[J].Rna,2010,16(7):1293-1300.41.Bortolin-CavailleML,CavailleJ.TheSNORD115(H/MBII-52)andSNORD116(H/MBII-85)geneclustersattheimprintedPrader-WillilocusgeneratecanonicalboxC/DsnoRNAs[J].NucleicacidsRes,2012,40(14):6800-6807.42.EnderC,KrekA,FriedlanderMR,etal.AhumansnoRNAwithmicroRNA-likefunctions[J].MolCell,2008,32(4):519-528.43.TaftRJ,GlazovEA,LassmannT,etal.SmallRNAsderivedfromsnoRNAs[J].Rna,2009,15(7):1233-1240.44.LiW,SaraiyaAA,WangCC.GeneregulationinGiardialambiainvolvesaputativemicroRNAderivedfromasmallnucleolarRNA[J].PLoSNeglTropDis,2011,5(10):e1338.45.MacraeIJ,ZhouK,LiF,etal.Structuralbasisfordouble-strandedRNAprocessingbyDicer[J].Science,2006,311(5758):195-198.46.MaciasS,PlassM,StajudaA,etal.DGCR8HITS-CLIPrevealsnovelfunctionsfortheMicroprocessor[J].NatStructMolBiol,2012,19(8):760-766.47.LafontaineDL,TollerveyD.Nop58pisacommoncomponentofthebox124 综述C+DsnoRNPsthatisrequiredforsnoRNAstability[J].RNA,1999,5(3):455-467.48.SemenovDV,VratskihOV,KuliginaEV,etal.Splicingbyexonexclusionimpairedbyartificialboxc/dRNAtargetedtobranch-pointadenosine[J].AnnNYAcadSci,2008,1137(2):119-124.49.ZhaoX,YuYT.Targetedpre-mRNAmodificationforgenesilencingandregulation[J].NatMethods,2008,5(1):95-100.50.PolitzJC,HoganEM,PedersonT.MicroRNAswithanucleolarlocation[J].RNA,2009,15(9):1705-1715.51.ScottMS,OnoM.FromsnoRNAtomiRNA:Dualfunctionregulatorynon-codingRNAs[J].Biochimie,2011,93(11):1987-1992.52.OnoM,YamadaK,AvolioF,etal.AnalysisofhumansmallnucleolarRNAs(snoRNA)andthedevelopmentofsnoRNAmodulatorofgeneexpressionvectors[J].MolBiolCell,2010,21(9):1569-1584.53.MleczkoAM,Bakowska-ZywickaK.WhensmallRNAsbecomesmaller:emergingfunctionsofsnoRNAsandtheirderivatives[J].ActaBiochimPol,2016,63(4):601-607.54.RunteM,VaronR,HornD,etal.ExclusionoftheC/DboxsnoRNAgeneclusterHBII-52fromamajorroleinPrader-Willisyndrome[J].Humangenetics,2005,116(3):228-230.55.SridharP,GanHH,SchlickT.AcomputationalscreenforC/DboxsnoRNAsinthehumangenomicregionassociatedwithPrader-WilliandAngelmansyndromes[J].JBiomedSci,2008,15(6):697-705.56.YuF,BrackenCP,PillmanKA,etal.p53RepressestheOncogenicSno-MiR-28DerivedfromaSnoRNA[J].PloSone,2015,10(6):e0129190.57.PattersonDG,RobertsJT,KingVM,etal.HumansnoRNA-93isprocessedintoamicroRNA-likeRNAthatpromotesbreastcancercellinvasion[J].NPJbreastcancer,2017,3(1):25.58.ElenaS.Martens-Uzunova1YH,AntonKalsbeek1,etal.C/D-boxsnoRNA-derivedRNAproductionisassociatedwithmalignanttransformationandmetastaticprogressioninprostatecancer[J].125 综述Oncotarget,2015,6(3):17430-17444.59.PanYZ,ZhouA,HuZ,etal.SmallnucleolarRNA-derivedmicroRNAhsa-miR-1291modulatescellulardrugdispositionthroughdirecttargetingofABCtransporterABCC1[J].DrugMetabDispos,2013,41(10):1744-1751.126 致谢致谢时光荏苒，岁月如梭，毕业在即，回首往昔，多少感激，永驻心底，任凭时光流逝，永远难以忘记！首先要特别感谢我的导师单保恩教授！老师渊博的学识和独特的人格魅力让我深深敬佩与景仰！您是我科研工作的灯塔，为我的科研之路指引航向。对学生，您诲人不倦；对实验室，您殚精竭虑！您对我学习、生活、工作中的教诲和帮助，学生将永远铭记！衷心感谢科研中心的赵连梅副教授，我的课题离不开您的悉心指导！从论文的开题到答辩，您的帮助贯穿始终！您渊博的学识，敏锐的思维，对学习的精益求精，对工作的尽善尽美，都是我学习的榜样！在此向您表示衷心的感谢！衷心感谢河北医科大学第四医院科研中心及肿瘤研究所的桑梅香教授、郭炜教授、董志明教授、赵瑞撵老师以及戴素丽、魏新如、古丽娜、刘飞等师弟师妹在实验过程中给了我许多帮助，对我遇到的问题不吝赐教，使我受益匪浅。衷心感谢临床生物细胞室李巧霞主任、艾军老师和何东伟、周宏伟、周杰娜等同事在实验过程中给予我的帮助，你们的热情与耐心让我倍感温暖与动力，使我的实验得以顺利完成！感谢同我并肩奋斗在省四院科研中心的各位师兄师姐、师弟师妹，大家团结互助的融洽气氛使实验室如一个大家庭一般温暖和谐！作为其中一员，我深感荣幸，谢谢大家！衷心感谢河北医科大学研究生学院和河北医科大学第四医院教务处全体领导、老师的大力支持与帮助！衷心感谢参与我论文评审和答辩的各位老师，你们给了我一个审视三年来学习成果的机会。在此，我谨向各位老师致以深深的谢意。最后，我要深深感谢我的父母、爱人和孩子！在求学的日子里，您们的鼓励与支持是我前行的最大动力！127 个人简历个人简历一、一般情况姓名张璁性别女民族汉族出生日期1985年11月4日籍贯吉林省桦甸市二、个人经历2004年9月至2009年7月河北医科大学医学检验专业本科2009年9月至2012年6月河北医科大学医学免疫学专业硕士2015年9月至今河北医科大学免疫学专业博士三、发表论文1.CongZhang,Lian-meiZhao,HaoWu,GuoTian,Su-liDai,Ri-yangZhao,Bao-enShan.C/D-BoxSnord105bPromotesTumorigenesisinGastricCancerviaALDOA/C-mycPathway.CellPhysiolBioche,2018;45(6):2471-2480.(SCI,IF=5.104)2.MaM,YangX,ZhaoL,LiuL,ZhangC,WangX,ShanB.Mda-7/IL-24inducesthedifferentiationofBcelllymphomaviaactivationoftheP38mitogenactivatedproteinkinasesignalingpathway.MolMedRep,2017,11,16(4):5633-5642.(SCI,IF=1.692)3.周欣亮,张璁,王玉栋等.胃癌中DNA甲基化对miR-200c141表达影响的研究[J].中国肿瘤临床,2017,44(2):73-77.4．周欣亮,张璁,袁虎方等.miR-200c在胃癌中的表达水平与患者临床病理特征的关系[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2017,24(5):538-543.四、承担课题情况1.赵连梅、檀碧波、张璁、马鸣、丁海霞、戴素丽、韩路娟、颜晰、魏思思、赵日旸.lncRNA-AL139008.2介导的巨噬细胞极化在胃癌免疫微环境中的作用及机制研究，国家自然科学基金，课题号：8177101089，起止年月：2018.1-2021.12（第三主研人）2.马鸣、单保恩、杨兴肖、张璁、戴素丽、韩丽娜、武一鹏、魏思思.128 个人简历基于CREB/GRK3通路探讨木鳖子乙醇提取物对羟基桂皮醛逆转食管癌发生、发展过程及其作用机制研究，国家自然科学基金，课题号：8170110760，2018.1-2020.1（第四主研人）3.张璁、田国、刘东新、华科雷、魏思思、武一鹏、艾军、赵连梅.非编码RNA-snord105b在胃癌发生发展中的作用及机制研究，河北省卫计委重点研究课题，课题号：20170146，2016.5-2018.6（第一主研人）4.张璁、赵连梅、霍炳杰、戴素丽、赵瑞撵、赵日旸、单保恩.黄芪建中汤通过免疫调节机制逆转胃癌不典型增生的研究，河北省中医药管理局课题，课题号：2018135，2017.9-2019.9（第一主研人）5.张璁.胃癌中非编码RNA-Snord105b的表达水平及作用的研究，河北省教育厅研究生创新资助项目，2017/3-2018/12（第一主研人）6.李巧霞，高立平,李宏,张璁等.IL-17/TPL-2/TAK-1信号通路在胃癌侵袭、转移中的作用及机制研究，河北省自然基金课题，课题号：H2016206209（第四主研人）129
