血清浓度及饥饿时间在hela细胞g0-g1期同步化中的影响

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1、血清浓度及饥饿时间在HeLa细胞G0/G1期同步化中的影响【关键词】HeLa细胞;血清饥饿法;细胞周期同步化在细胞周期的相关研究中通常要获得静止期细胞,而根据研究者所需细胞群所处细胞周期的时相不同,又有多种方法可供选择。其中,血清饥饿法是能将细胞周期停滞于G0/G1期同时又较少影响细胞周期发育进程的一种简便有效的同步化方法［1,2］。但采用血清饥饿法对不同细胞系进行同步化处理时,所得的效果又千差万别,而且大多数实验中无法任意选择已经摸索好条件的细胞系,故实验室所用细胞的血清饥饿法条件摸索在实验中极为重要［3］。重点分析了人类宫颈癌细胞（He

2、La细胞）的同步化效果,并对血清浓度及饥饿时间进行了比较研究。1材料和方法1.1材料人类宫颈癌细胞（HeLa细胞）引自中国科学院上海细胞所。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品。胎牛血清为HYclone公司产品。胰酶、碘化丙啶（PI)及胰核糖核酸酶(RNaseA)为美国Sigma公司产品。FACSVantageSE型流式细胞仪为BD公司产品。1.2方法1.2.1细胞培养培养基为含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液,培养条件为37℃、50mL/LCO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养。1.2.2血清饥饿处理将HeLa细胞

3、培养至指数生长期后,弃掉原培养液,更换培养液的血清浓度分别为:0、1、2、5、10、100mL/L,继续培养,然后分别在培养的20、26、32、38、44、50、56、62、68、74h收集细胞,每个处理独立重复实验3次。1.2.3细胞周期检测消化细胞,离心后弃胰酶,PBS洗涤离心2次后弃上清。然后将采集的细胞均匀地分散在750mL/L的预冷乙醇中,置4℃冷藏备用。检测时,用PBS离心洗涤细胞2次,除去乙醇,加少量PBS将细胞吹散(每份要求细胞数为5～10×105),加入RNaseA(终浓度为0.5g/L),37℃反应30min,加PI染液

4、(终浓度为50mg/L)（PI染液含TritonX100）,避光染色15min,用FACSVantageSE型流式细胞仪检测。实验完毕后采用cellquest软件分析各期的细胞含量［4］。2结果2.1血清浓度及饥饿时间与细胞同步化程度的关系流式细胞术（FCM）检测的结果显示:（1）当血清浓度为0、1、2、5、10mL/L,饥饿时间为20～26h便可获得80%～90%的G0/G1期细胞,此时可能饥饿仍不充分,有一定量的细胞并未停在G0/G1期,而发生“漏出”现象,漏出的细胞缓慢进入S期甚至G2/M期［5］;（2）当血清浓度处于0、1、2mL

5、/L且饥饿时间达到44h以上时,可以获得接近100%的G0/G1期细胞;(3)当血清浓度处于0、1、2mL/L时,饥饿的20h以上的任何时间段,都可以收获约80%以上的G0/G1期细胞;（4）当血清浓度为5、10、100mL/L,饥饿时间达到32h以上时,G0/G1期细胞含量均低于83.13%,所以在HeLa细胞周期相关研究中,如果想要获得高纯度的G0/G1期细胞,血清浓度应选择为0、1、2mL/L（图1）。2.2血清浓度及饥饿时间与HeLa细胞凋亡的关系根据之前的分析结果,要想获得超过90%的G0/G1期细胞,同步化实验中血清浓度应选择为

6、0、1、2mL/L。对于获得将近100%的G0/G1期细胞,3种血清浓度的饥饿作用结果相差不大,但是较低血清浓度的长时间培养势必带来大量的凋亡细胞,需要研究的是究竟哪一种血清浓度,多长的培养时间对细胞的影响较小？检测结果显示:在饥饿时间低于38h时,3种血清浓度所带来的凋亡细胞均较少（低于4.5%）,但从38h之后,细胞凋亡开始逐渐增加,当饥饿时间超过50h,低浓度血清所造成的细胞凋亡比例要高于较高浓度的血清（图2）。综合以上的结果,如果既考虑较高G0/G1期的细胞含量,又要减少凋亡细胞的比例,在进行HeLa细胞周期同步化时,可以选择的血清

7、浓度为0mL/L、1mL/L和2mL/L,血清饥饿时间应考虑选择在44～50h为宜,最好选择在44h,即饥饿时间越短越好,此时的凋亡细胞低于10%,远远少于饥饿50h所产生的凋亡细胞（20%左右）。3讨论细胞分裂周期是一组和谐的、高度调节性的系列事件。细胞周期的准确调控对生物的生存、繁殖、发育和遗传均是十分重要的。目前,众多与细胞周期相关的实验要求获得大量处于“基态”的细胞,即G0/G1期细胞,这些细胞可用于观察细胞的外界因素对细胞周期的影响和分析其作用机制。血清饥饿法正是一种可快速地获得大量G0/G1期细胞的方法,同时血清饥饿法因对细胞的

8、干扰极小,而广泛应用于各实验室。研究中分析了血清饥饿法中HeLa细胞同步化的影响因素:（1）当血清浓度处于0～10mL/L,饥饿时间为20～26h便可获得80%～90%的G0/G