银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织炎症信号tl

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1、银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织炎症信号TL【摘要】目的观察银杏叶提取物对局灶性脑缺血(FCI)大鼠脑组织Toll样受体4基因(TLR4)、蛋白表达的作用。方法参照Longa等方法制造FCI大鼠模型，将60只astercyclergradient);低温离心机(德国Eppendorf，Centrifuge5417R)，凝胶成像分析系统(SYNGENE)。　　1.2实验方法将60只大鼠随机分为：假手术组，模型组和银杏叶提取物组。每组又分为6、12、24和48h，4个亚组，每亚组均为5只大鼠。假手术组大鼠不插线，模型组及银杏叶提取物组线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞的动物模型。各组均为腹腔给

2、药，将药物以蒸馏水制成相同浓度混悬液(40mg/ml)，模型组及假手术组均给予1ml生理盐水，于手术完毕后3h给药1次，之后每天1次，直至相应时间点处死动物，取前囟前2mm至前囟后3mm脑组织，以进针点为界分为前后两部分，前部分取梗死灶周围脑组织，快速称取100mg，置于冰浴中的匀浆器并迅速匀浆，用于抽提总RNA。后部分脑组织用4%多聚甲醛固定液固定，4℃下持续固定24～48h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，在切片机上连续冠状切片，片厚5μm，-20℃保存。　　1.3RTPCR检测血肿周围脑组织TLR4mRNA的表达　　1.3.1梗死灶周围脑组织总RNA抽提与纯化在冰浴匀浆器中加入1mlT

3、rizol及100mg组织，迅速研磨，将匀浆液装于EP管中，加入200μl氯仿剧烈震摇30s，间隔放冰盒保温，反复震荡，4℃，12000r/min，低温离心20min，取上层水相转移至另一EP管中，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃过夜，4℃，12000r/min，低温离心20min，弃上清，加75%乙醇700μl轻轻混匀，4℃，12000r/min，低温离心10min，轻轻吸出上清，室温垂直放置20～30min凉干，加入DEPC水20μl溶解，留取1μl待测RNA浓度。　　1.3.2逆转录(RT合成第1条链cDNA)在PCR管中建立如下反应体系：依次加入如下试剂：5×RT缓冲液5μl、d

4、NTP(10mmol/L)2.5μl、Rnasin1μl、Primer1μl、M2MLV1μl，RNA及DECP水总共14.5μl。短暂离心→振荡混匀→4℃低温短暂离心;在PCR仪中，37℃反转录50min，95℃5min灭活反转录酶，立即冰浴，-20℃保存。　　1.3.3聚合酶链式反应(PCR)TLR4引物的设计GenBank中查到TLR4序列号为(#AF057025)，用GeneToll软件设计TLR4上游引物为5′GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT3′(2442～2463)，下游引物为5′ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT3′(2776～2795)，PCR反

5、应条件为预变性95℃×2min后，变性95℃×40s，退火52℃×40s,延伸72℃×1min，35个循环后72℃延伸10min，PCR产物为356bp。内参照βactin引物序列为：上游5′GCCATGTACGTAGCCATCCA3′，下游5′GAACCGCTCATTGCCGATAG3′，扩增产物为375bp。PCR反应条件：预变性95℃×2min后，变性95℃×30s,退火52℃×30s，延伸72℃×40s;35个循环后，最后延伸72℃×5min。　　1.4PCR产物的电泳鉴定各样品PCR产物5μl(βactin5μl)加于2%琼脂糖凝胶电泳槽齿孔中，取PCR标准同时电泳，作

6、为标准分子量参照。1×TBE50V恒压电泳40～60min，取胶置凝胶成像系统中，紫外光下拍照，结果扫入电脑备处理。　　1.5免疫组化染色免疫组化染色采用SABC法，石蜡切片经常规脱蜡，梯度酒精浸泡后充分水洗，置于3%H2O2/甲醛溶液中15min，以消除内源性过氧化物酶活性，浸入0.01mol/L、pH6.0枸橼酸盐缓液中，加热至92～98℃热修复抗原，20min后冷却至室温，0.01molPBS(pH6.0)振洗5min×3次，正常山羊血清封闭液孵育30min。滴加兔抗鼠TLR4多克隆抗体(1∶400)，4℃孵育过夜。0.01molPBS(pH6.0)振洗5min×3次，滴加辣根过氧化物

7、酶标记羊抗兔二抗，37℃孵育45min。吸去二抗，0.01molPBS(pH6.0)振洗5min×3次;加入辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育30min。0.01molPBS(pH6.0)振洗5min×3次，DAB显色，适时终止反应;苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗。　　1.6统计学处理数据均以x±s表示，组间比较运用单因素方差分析，两两比较运用q检验