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1、基层医院呼吸道合胞病毒检测方法的筛选许琴林素香郑水华珠海第二人民医院检验科，广东珠海519000[摘要]目的筛选快速、可靠、易推广的适合基层医院的呼吸道合胞病毒(respiratorysycytialvirus,RSV)的检测方法。方法双抗体夹心ELISA法、直接免疫荧光法、免疫层析金标法、桥联酶标法检测50例经临床确诊为RSV感染患儿的鼻咽分泌物。结果RSV阳性检出率依次为40%、88%、84%、80%。结论直接免疫荧光法快速、可靠、易推广，是基层医院RSV感染早期诊断的优选方法。[.jyqkpus）。1.3方法1.3.1DFA法检测RSV病毒抗原患儿鼻咽分泌物1mL，加PB
2、S，吸管吹打，2000rpm离心弃上清、吸取细胞悬液25μL，点于带孔玻片丙酮固定。滴加荧光标记的抗体37℃30min，洗片后封片，荧光显微镜观察。1.3.2金标法ICA法向反应板标本孔滴加标本,15min后观察反应板孔中C端和T端有无红色圆斑。1.3.3双抗体夹心ELISA法取试剂盒包被板每孔滴加稀释液和标本,阴阳对照孔分别加入阴、阳对照液，置37℃40min，洗涤甩干加酶标记物,置37℃20min,洗涤甩干加底物液。酶标仪450nm波长比色,空白孔调零，标本OD值与阴性对照孔OD值比值≥2.1为阳性。1.3.4碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP)样本加PBS吹打离
3、心弃上清，细胞悬液加封闭液后冲洗；加一抗后冲洗；加二抗后冲洗；加底物液5g／L甲基绿负染冲洗，普通光学镜下(10×40)镜检。1.4统计学处理采用SPSS10.0软件,对计数资料进行χ2检验,比较各方法间阳性率的差别。2结果DFA法：荧光显微镜下细胞内呈现黄绿色荧光为阳性，未发生抗原抗体特异性反应的细胞，被Evans蓝染成红色。放大200倍时，在视野中找到≥2个阳性细胞，判为标本阳性，50例标本中44为阳性，RSV阳性检出率为88%。ICA法：反应板孔C端和T端均出现红色圆斑为RSV阳性，反应板孔C端出现红色圆斑，T端不出现红色圆斑为RSV阴性,反应板孔C端或C端、T端均不出现
4、红色圆斑为失效，50例标本中42为阳性，阳性率84%。双抗体夹心ELISA法：50例鼻咽分泌物阳性20例，阳性率40%。APAAP法：普通光学显微镜下，RSV感染的鼻咽分泌物纤毛柱状上皮细胞胞质和膜可特异地染成玫瑰红色，核呈淡蓝色或无色，≥3个以上典型着色细胞判为阳性，50例标本中40为阳性，阳性率80%。见表1。3讨论呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒,这种病毒性肺炎也是婴儿猝死的病因之一[3-4]。目前临床常用检测RSV感染的方法有分离培养鉴定、间接荧光免疫法、直接荧光免疫法、桥联酶标免疫法、核酸检测、ELISA法。病毒分离培养虽是金标法，但费时、实验要求及
5、成本高，不易获得成功，不适合临床早期诊断和应急诊断需要。核酸杂交、RT-PCR技术检测RSA感染，敏感性、特异性高，能进行微量检测及RSA分型（A、B亚型），但实验条件要求严格，成本高，难以在基层医院普及。故本研究用DFA、ICA、APAAP、双抗体夹心ELISA四种方法检测RSV抗原，以筛选快速、准确、方便的适合基层医院检测方法。标本选自2014年3—4月确诊RSV感染小儿鼻咽分泌物。DFA、ICA、APAAP、双抗体夹心ELISA四种方法检测出的RSV阳性率依次为88%(44/50)、82%(42/50)、80%(40/50)、40%(20/50)。经统计学处理，前3种方法
6、,无显著差异;双抗体夹心ELISA法与前三种方法相比，RSV阳性检出率明显低于其它三种检验方法,差异有显著性。RSV成熟时,RSV病毒大部分在细胞内[5]。双抗体夹心ELISA法检测的是细胞外的病毒蛋白,当浓度低于ELISA法检测蛋白灵敏度的下限时检测不到病毒蛋白；另感染RSV后,需要一定的时间才能产生RSV-Ag,且RSV-Ag效价低也直接影响检测，因此该方法易造成阳性样本漏检。Koetz报道,ELISA检测RSV病毒其灵敏度不如免疫荧光技术，与本研究结果相符。ELISA法虽然易掌握，快速，但阳性率低，不适合临床应用。DFA法检测的是细胞内的病毒蛋白,故病毒蛋白的质量浓度相对
7、较高,此外DFA灵敏度高，能检出病毒的最低浓度为1.0PFU，阳性检出率88%为四种方法中最高。与其它三种方法相比，直接免疫荧光法灵敏度、特异性高[6]、操作简便，更符合基层医院的快速、简单、准确的诊断要求。国外对呼吸道病毒的检测大多采用DFA检测[7]。金标ICA法阳性率为84%，与DFA法相比，两种检测方法灵敏度无统计学意义,与文献报道一致[8]。金标法操作简便快速,30min可出结果,不需要贵重仪器,故金标法可作为基层医院门诊筛查。APAAP法在普通光学显微镜下可辨认，基层APAAP可
