健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠骨骼肌葡萄糖

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1、健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠骨骼肌葡萄糖【摘要】目的探讨健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)大鼠葡萄糖转运蛋白-4(GlucoseTransporter-4,GLUT-4)mRNA表达的的改善作用及机理。方法取ellitusrats.Methods60ellitusIRuscletissueeodelgroup(P<0.01).ConclusionStrengtheningSpleenandActivatingBloodPrescriptioncanup-regulatetheexpressionofGLUT-4geneinType2Dia

2、beticrats,andimproveinsulinresistance.　　KeyentalResearch　　目前普遍认为，IR和Ins分泌缺陷是2型糖尿病的发病基础，其中IR是贯穿于2型糖尿病发生、发展的全过程的重要因素，IR被认为是基因与环境间相互作用的结果。在众多候选基因中，GLUT-4与2型糖尿病胰岛素抵抗的发生关系密切[1]。本实验以健脾活血方治疗2型糖尿病IR模型大鼠，观察其对2型糖尿病IR大鼠GLUT-4mRNA表达的改善作用并探讨其机理。　　1材料　　1.1动物DF-U50V型)中保存备用。整个实验过程中模型组大鼠死亡2只，中药低剂量组大鼠死亡1只。　　2.2检测指标及方

3、法　　2.2.1空腹血糖(FBG)测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12h，断尾采血。用血糖仪测定血糖。　　2.2.2空腹胰岛素(Fins)测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12h，眼眶静脉丛取血5ml，用LG-10A离心机37℃恒温离心(2500r/min,10min)15min，取血清，采用放射免疫双抗体法测定。　　2.2.3RT-PCR法检测骨骼肌GLUT-4mRNA的表达提取骨骼肌总RNA。实验步骤：①骨骼肌组织匀浆：于冰上进行。取100mg骨骼肌组织，放入玻璃匀浆器中，加入Trizol试剂1ml研磨。②25℃水浴箱中孵育5min。③将匀浆产物移入1.5ml离心管中，加入氯仿0.2ml，混

4、摇15s，室温放置5min。④4℃离心(12000r/min)15min。⑤将上层无色液体移入1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min后混匀。⑥4℃离心(12000r/min)15min。⑦去上清液。加入75%乙醇1ml，4℃离心(7500r/min)5min。重复该步骤2次。⑧放置10min。⑨用水溶解后计算所提RNA量，使A260/A280比值保持在1.8以上。-70℃低温冰箱保存。　　RNA逆转录。实验步骤：①取上述标本RNA2μg，加入总量20μl下述混合液体：5×缓冲液4.0μl;10mmol/LdNTP2.0μl;逆转录酶0.5μl;上、下游引物各0.5μl;2

5、5mmol/LMgSO41.5μl;RNA2.0μg;加入去Rnase的蒸馏水9.5μl。②12000r/min，离心约1min。③42℃水浴箱中孵育45min合成cDNA。④95℃水浴箱中10min灭活逆转录酶。　　DNA聚合酶链反应(PCR)。实验步骤：①每个PCR扩增管中加总量25μl下述混合液：模板cDNA1.0μl;5×缓冲液5.0μl;10mmol/LdNTP2.0μl;Taq酶1.0μl;上、下游引物各0.5μl;加入双蒸水15.5μl。②振荡，略离心上述混合液。③PCR扩增仪扩增。反应条件：变性,94℃30s;退火,60℃60s;延伸,70℃60s。共做36个循环后，72℃延伸

6、5min。　　RT-PCR产物分析(光密度扫描法)。取10μlPCR扩增产物10μl以1.5%琼脂糖凝胶，100V电压电泳60min，GoldVieRNA表达的影响RT-PCR产物在琼脂糖电泳凝胶紫外灯下均可见：各组β-actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为300bp。骨骼肌GLUT-4mRNA的500bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异，模型组大鼠骨骼肌GLUT-4mRNA的表达减弱，与空白组大鼠比较有显著性差异(P<0.01);各治疗组大鼠骨骼肌GLUT-4mRNA的表达增强，以罗格列酮组和健脾活血方高剂量组的改善最为明显，与模型组比较有显著性差异(P<0.01);健脾活血

7、方高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。图1～2和表4。表4对大鼠骨骼肌中GLUT-4/β-actinmRNART-PCR电泳产物灰度扫描比值的影响与模型组比较，﹡﹡P<0.01，﹡P<0.05　　4讨论　　GLUT-4是一种分子量为45～55kD，含509个氨基酸单一多肽链的糖蛋白，具有12个跨膜螺旋片段。GLUT-4存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中。在没有胰岛素刺激时主要