hplc法测定茯砖茶中芦丁含量

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1、HPLC法测定茯砖茶中芦丁含量建立了茯砖茶中主要黄酮类物质芦丁的高效液相色谱测定方法。采用HypersilODS色谱柱C18色谱柱，流动相：A乙腈；B磷酸溶液(pH=2.5)，梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长258nm，样量为20?L，柱温30℃。对照品芦丁的回归方程Y=16007.7ρB(?g/mL)-11115.2,R=0.9993，线性范围为10.000~80.000mg/L，平均回收率99.0100%，RSD为2.0700%。测得茯砖茶中芦丁含量为0.1435%，RSD为3.4900%。该方法简便、快速、准确，可用于茯砖茶中芦丁含量的测定。关键词：茯砖茶；芦丁；HPLC基

2、金项目：湖南省科技厅重大研究项目(2009NK2004)；湖南省高校产学研合作示范基地产业化项目(11CY003)；2010年湖南省高校产学研合作示范基地建设项目(项教通[2010]235号)；湖南城市学院科技计划项目(2011xj001)。　　　近年来许多药理研究表明，黄酮类物质在防止皮肤疾病[1]、增强免疫力和预防心血管疾病[2]以及抗氧化活性[3]等方面具有重要生物活性与功效，而芦丁是黄酮类物质中典型的代表之一。笔者用芦丁作为标准品，建立了测定茯砖茶提取液中芦丁的高效液相色谱方法。目前，对茶叶中黄酮类物质的分析方法主要有分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)[4-5]。分光光度法

3、的灵敏度较差，且只能够测出总黄酮，无法具体得出芦丁的含量。高效液相色谱法因其灵敏度高、专一性强等优点，是目前测定黄酮类物质的主流方法。梯度洗脱高效液相色谱存在分析时间长或分离效果差的缺点，后来开发的高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)法[6]虽然可以克服上述缺点，但仪器昂贵，不适用于常规分析检测。笔者提出一种简便、有效的HPLC梯度洗脱分析方法，分析测定茯砖茶中的主要黄酮类成分芦丁的含量，并对此方法进行了方法的系统考察。1材料和方法1.1仪器与试剂高效液相色谱仪(岛津公司)，包括LC-10AT型输液泵，SPD-10A型紫外检测器；HypersilODS色谱柱(150.0mm×4.

4、6mm，5.00?m，依利特公司)，U3010紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，HT-250型超声波清洗机(山东济宁亨通电子设备厂)，乙腈(色谱纯),磷酸(分析纯)，2次蒸馏水(自制)，芦丁(泽朗医药科技公司)，茯砖茶产自安化，由益阳茶厂有限公司提供。1.2对照品溶液的配制准确称取干燥恒重的芦丁标准品10.080mg，用乙醇溶解定容至100.0mL，摇匀后超声处理5.0min，得浓度为0.1008g/L的芦丁标准液，装入棕色瓶中保存备用。1.3供试品溶液的配制称取5.0000g茯砖茶，加95%乙醇100.0mL，回流提取60.0min，过滤，取2.5mL滤液，加乙醇定容至10.0mL

5、，过0.45?m微孔滤膜，作为供试品溶液。1.4色谱条件HypersilODS色谱柱，流动相：A为乙腈，B为磷酸溶液(pH=2.5)，梯度洗脱，流动相流速1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测波长为258nm，进样量20?L。洗脱程序为0.0～6.0min，8.0000%A～15.0000%A；6.0～15.0min，15.0000%A～30.0000%A；15.0～25.0min，30.0000%A～8.0000%A，25.0～30.0min，8.0000%A停泵[1]。2结果与分析2.1系统适用性试验分别取加入了对照品的供试品溶液，供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱

6、条件测定，记录色谱图，供试品（红色线）和加入了芦丁标准品的供试品（蓝色线）的色谱图，如下，在19.6min处，供试品谱图有个较小的峰，加入芦丁标准品谱图在对应位置有个稍大的峰，对照可知芦丁的保留时间为19.6min。2.2检测波长的选择芦丁紫外吸收光谱图显示，分别在212，258和362nm3处具有峰值吸收。其中212nm附近的吸收值最大，但干扰也大；362nm处虽干扰可能最小，但其吸收值也最小。故选择检测波长为258nm[2]。2.3流动相的选择甲醇和乙腈是最常用的两种液相色谱流动相。初步实验表明，以甲醇作为流动相的分离效果和检测灵敏度均明显不如以乙腈作为流动相。流动相中加入酸有助于

7、各组分的分离和得到较好的峰型，含不同的酸(磷酸和乙酸)对分离效果也有重要影响。用含有乙酸的流动相时，流出物色谱峰形拖尾严重，而改用含有磷酸的流动相时，分离效果就有较大改善；酸的浓度也有影响，流动相的pH不宜低于2.5。考察改变乙腈和磷酸的比例时发现，乙腈浓度为30.0000%为宜，当乙腈浓度过高时，出峰时间提前，但不利于各个组分的分离。2.4线性回归方程、检测限分别移取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL芦丁标准液于10.0mL容量瓶中，