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时间:2018-11-04
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1、简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟3.PBS洗净:3min*34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2*5min6.羊血清封闭:37度,20分钟7.一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度 1-2小时8.4度 PBS洗净,3min*5次9.二抗 37度小于一小时10.37度 PBS洗净,3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备(一)制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
2、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×106~1×107/ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl) 的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃30min 用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min ↓
3、 弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇 ↓ 4℃30min 用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入 1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察, 视细胞浓度加入100~500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保
4、存5~7天)(二)试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。 3. 10%FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。(三)注意事项 1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好,否则易发生非特异
5、性荧光染色。 附: 1.DPBS(×10,贮存液) NaCl80g KCl2g 蒸馏水加至1000ml Na2HPO411.5g临用时用蒸馏水1∶10稀释 KH2PO42g 2. 洗涤液 DPBS 900ml FCS50ml(终浓度 5%) 4%NaN3???50ml(终浓度0.2%) 3. 固定液 DPBS 1000ml 葡萄糖 20g(终浓度2%) 甲 醛 10ml NaN3 0.2g(终浓度0.02%)我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1.取出细胞爬片放到35m
6、m或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。3.0.2%TritonX-100通透10分钟,PBS洗三遍。4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。5.一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,PBS洗三遍。6.二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时,PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核,然后直接照
7、荧光片。8.蒸馏水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议:1.还是染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
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