结核杆菌hsp65和hgmcsf双顺反子表达质粒

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1、结核杆菌Hsp65和hGMCSF双顺反子表达质粒【摘要】目的：应用分子生物学技术，构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒，并在真核细胞中表达.方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因，同时从质粒pORFhGMCSF中扩增出基因佐剂hGMCSF，分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A（MCSA）和B（MCSB）中，构建pIHsp65GM真核表达质粒，并转染HepG2细胞中表达和检测.结果：酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64kb和0.47kb，测序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序

2、列与GenBank上公布序列完全一致；免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞；ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGMCSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论：成功构建和表达了pIHsp65GM质粒，为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.【关键词】结核分枝杆菌；热休克蛋白65；人粒巨噬细胞集落刺激因子；双顺反子；基因佐剂　　0引言　　卡介苗（bacillecalmetteguerin,BCG）是已被广泛应用于预防结核病（tuberculosis,TB）的减毒活疫苗.由于结核DN

3、A疫苗的制备简便、免疫效果好，目前已经成为TB的热门侯选疫苗之一［1］.结核杆菌热休克蛋白65KD基因（heatshockprotein65KD,Hsp65）是研究最早的结核抗原之一，可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应［2］.粒细胞吞噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GMCSF)作为良好的基因佐剂,可以利用其上调机体免疫水平的作用增强DNA疫苗的效能［3-4］.虽然Hsp65抗原和GMCSF分别在感染免疫中的作用已经被研究证实有效，但对人GMCSF协同H

4、sp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应答特点和保护力尚不清楚［5］.我们将两者同时克隆到同一载体上，构建含结核杆菌Hsp65和基因佐剂hGMCSF的双顺反子真核质粒，旨在为进一步了解结核DNA疫苗的免疫效果奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　结核分枝杆菌H37Rv株基因组，大肠杆菌DH5α，载体pIRES和质粒pORFhGMCSF(暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室提供)；ExTaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，限制性内切酶NheI，EcoRI,XbaI和NotI，DL1kbmarker，质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收纯化试剂盒(大连宝生物公司

5、)；两对PCR引物、重组质粒上目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成；Transmaster转染试剂（广州博理生物科技公司）；即用型免疫组化BiotinSPHRP试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒（北京鼎国生物科技公司）；鼠抗人Hsp65蛋白单克隆抗体和人hGMCSF蛋白ELISA检测试剂盒（深圳市晶美生物科技公司）.　　1.2方法　　1.2.1目的基因　　Hsp65和hGMCSF的PCR扩增参照GenBank上结核分枝杆菌H37Rv株Hsp65基因CDS序列（NCBI登陆号：M15467）分别设计引物进行PCR扩增.　　1.2.2pIHsp65真核载体

6、的构建与鉴定　　将Hsp65的PCR产物经过回收纯化后与载体pIRES，同时用NheI和EcoRI双酶切，酶切后进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4DNA连接酶连接24h.转化用低温CaCl2制备的E.coliDH5α感受态细菌，然后涂布于含氨苄青霉素50μg/mL的LB固体培养基中.次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃下150r/min振荡培养过夜.先取少量菌液煮沸作为模板进行菌落PCR检测是否有Hsp65的存在，将菌落PCR筛选呈阳性的

7、菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA.将提取的质粒DNA用NheI和EcoRI双酶切，进行电泳检测，以DL1kbmarker为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定.测序采用Sanger双脱氧链终止法，对插入序列的两端进行测定，测序工作由上海生物工程公司完成.　　1.2.3pIHsp65GM真核表达　　质粒的构建与鉴定同构建pIHsp65载体方法一样，将hGMCSF的PCR产物经过回收纯化后与载体pIHsp65同时用XbaI和NotI双酶切，酶切产物经凝胶回收纯化后，将两者酶切纯化的产物按照3∶1的摩尔比混合，用T4DNA连接酶连接24h,然后转

8、化感受态细菌E.coli