高效液相色谱法测定左亚叶酸钙注射液有关物质的条件

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1、高效液相色谱法测定左亚叶酸钙注射液有关物质的条件【摘要】目的建立左亚叶酸钙注射液有关物质测定方法。方法采用反相离子对试剂高效液相色谱法，色谱柱为VarianC18（250mm×4.6mm,5μm），流动相：（磷酸氢二钠2.2g加10%四丁基氢氧化铵8ml，以水稀释到780ml，用1→10磷酸调节pH至7.8）:甲醇为78:22；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长286nm。结果左亚叶酸钙质量浓度为0.04～120μg/ml内，线性关系良好（r=0.9999）。结论方法专属性好，准确，灵敏，用于左亚叶酸钙注射液有关物质测定结果可靠。【关键词】高效液相色谱法；左亚叶酸钙注

2、射液；有关物质；10－甲酰叶酸【Abstract】ObjectiveToestablishthemethodtodeterminetherelatedsubstanceincalciumlevfolinateinjection.MethodsTheRP-ionpairHPLCmethodsn（250mm×4.6mm,5μm），themobilephaseconsisted0.8mg/mltetrabutylaminouriumhydroxideacidand2.2gdisodiumhydrogenphosphate，adjustedtopH7.8ethanol78:22，atafl

3、ol/min，thetemperatureofthecolumn.ResultsThelinearcalibratiencurvesobtainedinconcentrationrangeof0.04～120μg/mlatcalciumlevfolinate（r=0.9999）.ConclusionThemethodissimple，accurate，sensitiveandreliablefordeterminationtherelatedsubstanceincalciumlevofolinateinjection.【Keylevofolicacidinjection；rela

4、tedsubstance；10-formylfolicacid左亚叶酸钙注射液是采用经手性拆分亚叶酸钙后所得左亚叶酸钙原料药配制而得的一种手性药物注射剂。其广泛用于贫血、肿瘤的治疗。该品种是安徽省科隆药物研究所研制的一个新药。原有的HPLC有关物质测定方法色谱条件为：C18柱（250mm×4.6mm,5μm）,流速1.0ml/min，柱温：40℃，流动相：（磷酸氢二钠2.2g加10%四丁基氢氧化铵2ml，以水稀释到780ml，用1→10磷酸调节pH至7.5）:甲醇为78:22，供试液浓度：0.14mg/ml。但是在用该色谱条件进行测定左亚叶酸钙注射液有关物质时，发现杂质峰没能得到基

5、线分离，且不能检测到杂质10－甲酰叶酸。根据同系物HPLC色谱条件相近原则，参考《中国药典》［1］2005年版注射用亚叶酸钙冻干粉针有关物质测定色谱条件及《欧洲药典》［2］左亚叶酸钙原料药有关物质测定色谱条件，在此基础上用四点法求出容量因子对离子对试剂浓度和pH值的回归多项式，进而求得流动相离子对试剂浓度和pH值的最佳值。1仪器与试剂1.1仪器Agilent1100液相色谱仪，包括Agilent色谱工作站，单元泵，可变波长紫外检测器，外配AT-130柱温箱，TU-1800紫外可见分光光度计。1.2试剂甲醇：色谱纯。磷酸氢二钠，10%四丁基氢氧化铵水溶液，磷酸，均为分析纯。左亚叶酸钙

6、对照品（含量99.2%，水分17%，批号20041029）;亚叶酸钙消旋体（含量99.2%，水分11.7%，批号20040820）;10－甲酰叶酸（《美国药典》认可标准品，含量>99.5%）。左亚叶酸钙注射液（本公司生产，批号050701，50mg/5ml）。2色谱条件色谱柱：VarianC18（250mm×4.6mm,5μm）;流速：1.0ml/min;柱温：40℃;检测波长：286nm;进样量：20ml。3四点法求出各组分峰响应面多项式按Schoenmakers公式组分的容量因子k’的对数和常用色谱参数（流动相中强溶剂的比例，pH值，柱温Ｔ-1等）呈一次或二次线性关系［3

7、］，对二参数即二因子体系可采用下列公式Lnk’=β0+β1x1+β2x2+β12x1x2，在本实验中把公式定为Lnk’=A+B［C］+C［pH］+D［C］［pH］其中A、B、C、D为多项式的未定系数，［C］为离子对试剂浓度mg/ml，［pH］为流动相最终pH值，根据亚叶酸钙有关物质测定HPLC色谱条件［C］为0.8mg/ml，［pH］为8.28，取用浓度为0.1mg/ml的左亚叶酸钙注射液水溶液用该色谱条件进行有关物质测定，色谱图见图1。（略）发现各杂质峰基本能得到基