肝癌患者手术前后外周血afp mrna定量检测的

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1、肝癌患者手术前后外周血AFPmRNA定量检测的【摘要】目的:研究肝细胞肝癌患者手术前后外周血AFPmRNA表达量的变化，分析其作为微转移标记物的可行性及与复发转移的关系.方法:使用实时荧光定量RT－PCR检测64例肝细胞癌患者手术前后外周血AFPmRNA表达量,并进行平均6mo以上的随访；同时以8例肝硬化患者、4例肝增生患者、8例肝血管瘤患者和10例健康志愿者作为对照组，对比检测其外周血单核细胞AFPmRNA的表达量.结果:复发34例.HCC组的术前AFPmRNA表达量明显高于对照组.术前外周血AFPmRNA相

2、对HCC的灵敏度为85.9%，特异性为90.3%，准确率为87.4%.HCC患者术后外周血AFPmRNA表达量明显高于术前.HCC组外周血术前、术后AFPmRNA水平表达量与术后复发转移有明显相关性，与TNM分期、血管癌栓或侵犯有相关性，但与术时肿瘤数目、癌细胞分化程度、包膜完整性均与血清AFP浓度无相关.术后HCC组外周血AFPmRNA表达量与肿瘤大小有相关性.结论:实时荧光定量RTPCR法检测HCC患者外周血AFPmRNA表达量有很高的敏感性和特异性，可以反映HCC患者血中是否存在肝癌细胞.手术可促进部分

3、HCC细胞脱落入血.监测外周血AFPmRNA水平对术后早期复发转移有预测价值.【关键词】癌肝细胞甲胎蛋白RNA信使逆转录聚合酶链反应肿瘤转移0引言肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,根治性切除术是其最有效的治疗选择，但术后易复发，血源性播散是HCC复发转移的主要途径，因此早期发现外周血中微转移对于HCC的临床治疗和预后评估具有重要意义.甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)mRNA是HCC微转移检测常用的标志物［1］,但是其应用价值存在争议

4、［2］，故本研究应用实时荧光定量RTPCR技术检测HCC患者手术前后、对照肝病患者和健康志愿者外周血的AFPmRNA，分析AFPmRNA可否作为循环HCC癌细胞标志物，手术操作对HCC微转移的影响，以及与术后复发转移的关系.1对象和方法1.1对象前瞻性分析西南医院肝胆外科研究所自200509/200608初次入院治疗的HCC患者64（男57,女7）例,年龄25~69(46.0±10.6)岁，均行影像学(B超、CT和DSA)及血清甲胎蛋白(AFP)检测,并经术后病理证实为肝细胞癌患者，其中I期34例，II期

5、患者16例,III期11例,Ⅳ期3例.血清AFP＞20μg/L者47例.HCC患者术前肝脏储备功能评估：15min吲哚靛青绿储留率(ICGR15)均＜15%（平均5.5%）；ChildPugh评分A级60例，B级4例.所有手术均为开腹手术，其中行解剖性切除术27例，行非解剖性切除术37例.术后平均随访6mo以上.对照组患者:肝硬化8例；肝脏增生4例，肝脏血管瘤8例，正常对照10例.人淋巴细胞分离液由天津中科院生研所灏洋生物制造；RNA提取试剂盒RNAisoReagent和实时荧光定量RTPCR试剂盒（SY

6、BRPremixExTaqTM,PerfectRealTime）均为宝生物工程（大连）有限公司产品.BeckmanCS15R高速冷冻离心机为美国Beckman公司产品；PCRsystem2700型PCR仪为美国PE公司产品；LightcyclerⅡ荧光定量PCR仪为德国Roche公司产品.1.2方法1.2.1外周血标本HCC组患者分别在手术切皮前及关腹后从深静脉置管内抽取静脉血5mL，肝硬化组、肝脏增生组、肝血管瘤组患者也术前从深静脉置管内抽取静脉血5mL，健康志愿者抽取肘静脉血5mL，均肝素抗凝后，用人淋

7、巴细胞分离液分离外周血单核细胞.分离的单核细胞－80℃冰箱保存，待统一提取RNA.AFP表达阳性对照细胞系HepG2细胞株由本所实验室保存提供.1.2.2总RNA的提取及测定按照宝生物公司的RNA提取试剂盒RNAisoReagent进行.用紫外分光光度仪测量OD260/280比值并评估RNA的纯度，根据OD260/280比值计算总RNA的含量.RNA的完整性用10g/L琼脂糖凝胶电泳显示.1.2.3引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所用引物，AFPmRNA引物序列如下：正义链：5TCAGTGAGGA

8、CAAACTATTGG3，反义链：5CTCTTCAGCAAAGCAGACTTC3；βactin正义链：5AGCGAGCATCCCCCAAAGTT3，反义链：5GGGCACGAAGGCTCATCATT3.1.2.4反转录反应合成cDNA①按照宝生物公司的实时荧光定量RTPCR试剂盒进行，反应液体配制在冰上进行.我们采用20uL的反应体系(包括1000ng总RNA).②在