1,25二羟维生素d3对哮喘小鼠气道重塑及基质

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1、1,25二羟维生素D3对哮喘小鼠气道重塑及基质【摘要】目的:观察1,25二羟维生素D3(VD)对哮喘小鼠气道重塑及其肺组织中基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响,探讨VD在哮喘治疗中的作用。方法:BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组及VD组。卵蛋白致敏和激发建立慢性哮喘小鼠模型;HE染色观察各组气道结构改变情况;采用计算机图像分析系统评价各组气道重塑情况;采用RTPCR法检测各组的MMP9mRNA表达水平。结果:①HE染色提示哮喘组与对照组相比出现炎性细胞浸润增多、上皮细胞脱落及平滑肌细胞层增厚等气道

2、重塑改变,而VD组可部分逆转上述病理改变;②VD组的支气管内壁厚度、平滑肌层厚度和平滑肌细胞核数显著低于哮喘组,但仍高于对照组(P<0.05);③VD组肺组织MMP9mRNA表达水平均明显低于哮喘组,但仍高于对照组(P<0.05)。结论:VD干预可明显减轻慢性哮喘气道重塑的病理改变;并可通过部分抑制肺内MMP9的表达来延缓气道重塑进程。【关键词】哮喘气道重塑1,25二羟维生素D3基质金属蛋白酶9　　近年来气道重建在哮喘发病机制和治疗中的作用受到越来越广泛的关注,它被认为是哮喘发病机制的一个重要环节

3、和哮喘气道病理改变的重要基础,同时也是哮喘治疗的一大靶向目标。1,25二羟维生素D3［1,25(OH)2D3］是维生素D的活性代谢产物,它不仅是体内骨代谢及钙稳态的关键性调控因子,同时还是一种第二类固醇激素,能调节更为广泛的生理作用［1］。但目前国内外尚无其调节哮喘气道重塑的相关研究报道。本试验旨在利用卵白蛋白（ovalbumin,OVA）激发的慢性哮喘小鼠模型,探讨1,25二羟维生素D3对哮喘气道重构的干预作用,为其在哮喘的临床应用提供新的理论依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　OVA和1,25二羟维生

4、素D3为美国Sigma公司产品;氢氧化铝凝胶由上海生物制品研究所提供,TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品;Taq酶及逆转录RT试剂盒为美国Promega公司产品。　　1.2方法　　1.2.1实验动物分组及哮喘模型的制备　　4～6周龄健康BALB/c小鼠30只(清洁级,雄性,体质量18～22g),由第四军医大学动物实验中心提供。随机将小鼠分为3组:哮喘组、VD组及对照组,每组10只。哮喘组分别于第0、7、14天腹腔注射0.5mL致敏液(含OVA10μg十氢氧化铝凝胶2mg)进行致敏;从第21天开始为激发

5、阶段,将小鼠置于自制密闭箱内,给予雾化吸入25g/L的OVA溶液30min,其中第21天～第27天每日雾化1次,而后第28天～第77天隔天雾化1次,共激发8周;VD组以上述同样的方法用OVA进行致敏和激发小鼠,并在每次激发前1h分别予以腹腔注射100ng的1,25二羟维生素D3;而对照组则用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。末次激发后24h内处死动物,取右肺组织用锡铂纸包裹,即刻-70℃冻存,用于总RNA及总蛋白抽提,左肺经40g/L多聚甲醛固定后,石蜡包埋,切片,切片厚4μm,用于HE染色。　　1.2

6、.2肺组织形态学观察及图像分析　　肺组织切片行HE染色,400×光镜下观察肺组织病理学改变;另在200×光镜下,每只动物切片随机选取5个无软骨且平滑肌成环的完整细支气管横断面(无分叉及断裂),且气管最小径/最大径≥0.5,采用leicaQ500图像分析系统测定支气管基底膜周径(Pbm)、气管内管壁面积(MP9基因表达　　采用TRIzol一步法提取肺组织总RNA,提取的RNA,经紫外分光光度计测量A260和A280的值,判断其纯度,并由A260吸光度计算出RNA浓度。按照Promega公司的逆转录试剂盒进行逆转录为c

7、DNA后进行PCR扩增。MMP9引物为:上游5′GCCCTACAGCGCCCCCTACT3′,下游5′AGACACGCCCCTTGCTGAACA3′,扩增片段大小为400bp;扩增反应参数设置为:95℃预变性5min;95℃变性45s,57.5℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃保温7min。内参找GAPDH引物为:上游5′AACGACCCCTTCATTGAC3′,下游5′TCCACGACATACTCAGCAC3′,扩增片段大小为191bp,扩增反应参数为:94℃预变性5min;94

8、℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃保温7min。取PCR产物置于20g/L琼脂糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色,电泳条带经凝胶成像分析系统扫描及分析,并以内参照GAPDH条带进行标化,计算MMP9PCR产物的相对定量。　　1.2.4统计学处理　　各组实验数据以x±s表示,采用SPSS10.0软件进行统计学分析。当