新一代测序技术及其在小麦基因组研究中的应用

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1、读书报告一新一代测序技术及其在小麦基因组研究中的应用DNA测序技术是分子生物学研宂中最常用的技术。一代测序技术是20世纪70年代中期由FredSanger及其同事首先发明，其基本原理是聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。以此为基础延伸并发展起来的测序技术统称为第一代测序技术，其在分子生物学研宄领域发挥过重要作用［u。但随着研宄的不断深入，传统的测序方法表现出测序测度慢，获取信息tt小，人规模测序价格昂贵等缺点，已满足不了深度测序和重复测序等大规模核酸测序的需要，这就促使了新一代测序技术的产生。新一代测序技术又称为深度测序技术、第二代测序技术，以Roche/

2、454GenomeSequencerFLXSystem、Illumina/SolexaGenomeAnalyzerIIx和ABISOLIDSystem等测序平台为标志，其最主要的特征是高通ii测序，测序时间和成本都显著降低，因此通常又被称为高通《测序技术本文对新一代测序技术的基本原理及其在小麦基因组学研宄中的应用展开综述。1新一代测序技术的基本原理新一代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencingbysynthesis,SBS)或者边连接边测序(Sequencingbyligation,SBL)，即生成新DNA互补链时，加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，或者直接

3、加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化力一个测序峰值，获得互补链序列信息

4、41。下面分别对新一代测序平台Roche(454)GSFLXsequencer、Illuminagenomeanalyzer、AppliedBiosystemsSOLiDsequencer等的测序原理进行简述。1.1Roche(454)GSFLXsequencer在Roche/454测序平台巾主要应用的是焦磷酸测序(pyrosequencing)技术l5j。焦磷酸测序技术基于4种酶(DNApolymerase、sulfurylase、luciferase

5、、apyrase)在同一PCR反应体系中催化的酶级联化学发光反应，即将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号释放的有无和强度，就HT以达到实时测定DNA序列的目的。因而测序过程无需电泳，使用dNTP而不是ddNTP且无需荧光标记，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。1.2IlluminagenomeanalyzerIlluminagenomeanalyzer与Roche/454相同，都是应用了边合成边测序的Kl理，但区别在于二者的信号检测方法不同［6］。Illumina测序反应所用的核苷酸类似物经四种不同颜色的荧光标记，当DNA聚合酶合成互补链

6、吋，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA序列。1.1AppliedBiosystemsSOLiDsequencer与前两种测序方法不同，SOLiD(SupportedOligonucleotideLigationandDetectionSystem)系统是使用连续的分子杂交和连接来阆接推测序列的测序方案l7］。SOLID测序过程中没有采用惯常的聚合酶，而用了连接酶，其连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。探针3’端的第1、2位碱基是表征探针染料类型的编码区，即此二位碱基是确定的，卯且不同的碱基组合对应探针末端不同的荧光

7、素标记；3-5位为随机碱基，6-8位是XT以和任何碱基配对的特殊碱基，探针末端为荧光标记。连接反应中，DNA连接酶催化与待测片段第1、2位匹配的探针连接到接头配对引物上，待其与待测链结合后通过化学方法将探针第6-8位的碱基及末端荧光标记切除，释放出荧光团，通过捕获荧光确定待测链第1、2位碱基序列。与此同时洱加入探针进行连接，这时由于DNA链己延长了5个碱基，通过荧光信号检测到的则是模板链的6、7位碱基序列，如此重复，完成第一轮测序。重置后进行第二轮测序，此时所用的接头配对引物比第一次的引物少一个碱基，因而第二轮测序所得的模板序列为0、1位，5、6位，依次类推。经过几次测序后，每轮测序获得

8、的错开序列即可拼接成完整的序列。2新一代测序技术在小麦基因组研究中的应用2.1小麦基因组序列的测定小麦因其庞大的基因组序列严重阻碍了测序工作的开展，因而虽然名列世界上最重要的粮食作物之一，但小麦的全基因组测序迟迟没有完成。新一代测序技术在小麦基因组研究中的应用是先借助丁•散弹•射击或流式细胞分选(flow-cytometricsorting)技术将染fc体打碎或分离，继而对其进行测序、拼接，使得一系列染色体(臂)的序列得以测定。Br