1 引言 目前，生物修复被认为是最为经济有效的

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1、1引言目前，生物修复被认为是最为经济有效的　　1引言　　目前，生物修复被认为是最为经济有效的处理石油污染土壤的技术，主要依靠环境中的微生物以有机污染物为碳源进行新城代谢，从而净化土壤[1-2]。微生物细胞膜的功能之一是扩散屏障，即阻止碳氢化合物和亲脂性化合物向细胞内扩散[3]，但大量研究表明吸附在微生物细胞表面的烃类物质主要通过三种方式进入微生物体内，即被动运输，主动运输和整批转运[4]。Bateman等[5]发现即使在细胞外基质中加入ATP生成抑制剂，萘仍会顺利被转移到降解菌Pseudomonapuidat体内，因此认为萘通过简单扩散方式进入微生

2、物体内。Shishido[6]的研究结果表明，苯酚在浓度低于50mg·L-1时以主动运输方式进入降解菌体内，而在浓度较高时以被动运输的方式进入微生物细胞内。Kennedy[7]认为细菌直接吸附在油滴上然后烃类通过扩散或主动运输的方式进入菌株体内。BealR[8]观察到接种量高时PG201对正十六烷的降解率低于接种量低时十六烷的降解率，从而推测这一现象与正十六烷的运输方式有关。　　Steinbuchel和Ratledge[9-11]等人在研究中发现许多能降解烷烃类物质细菌在代谢过程中会产生不同的脂类物质，然后微生物将这些亲脂性物质以特定的形式储存在细

3、胞内。文章在此基上，利用两种高效石油降解菌DQ01和DQ02为对象，研究吸附在微生物表面的正十六烷以何种方式进入微生物体内，以及细胞内烷烃的存在形式。　　2材料和方法　　2.1实验材料和仪器　　无机盐培养基（MSM）：5%KH2PO4，0.1%NH4Cl，0.02%MgSO47H2O，0.0015%CaCl2，1mL微量元素/L培养基(每100mL溶液包含0.5mgCuSO4·5H2O，1.0mgH3BO3，1.0mgMnSO4·5H2O,7.0mgZnSO4)，去离子水定容到1000mL，115℃湿热灭菌20min。　　葡萄糖液体培养基：0.15

4、%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，去离子水定容到1000mL，115℃湿热灭菌20min。（fL培养液以6000r/min离心5min，过滤掉上清液后，剩下的菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次，并以5mL灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到无机盐培养基中，加入一系列不同浓度（1、10、20、30、40、50、100mg·L-1）的正十六烷，20min后将培养液离心，菌体用无机盐培养基清洗1次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0

5、）洗2次，以去除吸着在表面的烷烃。然后重悬于10mL10mmol·L-1的Tris-HCl(pH=7.5)中，冰浴超声破壁，每次3s共60次，每次间隔7s，离心分离(7000r/min,10min)，上清液用等体积正己烷超声萃取2次。收集有机相，并用无水硫酸钠脱水，在旋转蒸发定容到1mL，用GC测定浓度。富集的烷烃就是DQ01和DQ02体内烷烃的量。　　2.2.2菌种细胞内外正十六烷含量分析　　这部分实验是为了分析烷烃从细胞外进入细胞内是顺浓度梯度还是逆浓度梯度。具体方法如下：微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，然后4℃下储存。细胞

6、从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。培养液以6000r/min离心5min，然后菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次，以灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到一系列试管中，加入20mg·L-1十六烷，分别在1、2、5、10、15、20、30、40、60min里将细菌离心，菌体用无机盐培养基清洗1次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次，用GC测定清洗溶液中的正十六烷，即为吸着在微生物表面的烷烃。细胞膜内烷烃富集量的分析见2.2.1。　　2.2.3Na

7、N3抑制条件下，菌种运输富集正十六烷的试验　　微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。培养液以6000r/min离心5min，然后菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次，以灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到正十六烷培养基（DQ01和DQ02中正十六烷的浓度分别为20mg·L-1）中，30℃，150r/min培养25min，其中8.5min后加入30mmol·L-1的NaN3，分别在1min，4min，5min，8min，10min，14min，18min，25m

8、in取出5mL细菌离心，菌体用无机盐培养基清洗1次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2次，再用灭菌的无机