dna提取及常见问题分析与对策

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1、专业技术资料整理DNA提取和常见问题分析及对策主讲人：关锰WORD格式可编辑专业技术资料整理DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。WORD格式可编辑专业技术资料整理DNA提取原则.保证DNA结构的完整性.纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质.排除有机溶剂和金属离子的污染.蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度.排除其他核酸分子的污染WORD格式可编辑专业技术资料整理DNA提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它

2、WORD格式可编辑专业技术资料整理DNA提取的几种方法二、非染色体DNA的提取WORD格式可编辑专业技术资料整理质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法WORD格式可编辑专业技术资料整理线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法WORD格式可编辑专业技术资料整理CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖

3、、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。WORD格式可编辑专业技术资料整理CTAB法流程图WORD格式可编辑专业技术资料整理植物材料裂解液异丙醇沉淀WORD格式可编辑专业技术资料整理WORD格式可编辑专业技术资料整理液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液WORD格式可编辑专业技术资料整理WORD格式可编辑专业技术资料整理细胞裂解上层溶液干燥溶解WORD格式可编辑专业技术资料整理CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的

4、经典配方.Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；.EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；.NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；.CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；.β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。WORD格式可编辑专业技术资料整理CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。WORD格式可编辑专业技术资料整理

5、除蛋白质：?氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。?使用变性剂变性(SDS.异硫氰酸胍等）?高盐洗涤?蛋白酶处理WORD格式可编辑专业技术资料整理除多糖：>高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。>用多糖水解酶将多糖降解。>在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。WORD格式可编辑专业技术资料整理除酚类物质：>在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等>加入易与

6、酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合WORD格式可编辑专业技术资料整理除盐离子：70％的乙醇洗涤WORD格式可编辑专业技术资料整理TE中成分的作用>TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase>pH值为8.0，可防止DNA发生酸解WORD格式可编辑专业技术资料整理称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃)CTAB及β-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离心

7、管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4℃/-20℃保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干用TE溶解DNA,然后低温保存WORD格式可编辑专业技术资料整理应注意的问题材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮研磨：研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。细胞裂解：材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高

8、温温浴时，定时轻柔振荡。WORD格式可编辑专业技术资料整理应注意的问题DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙