中药血清的保护作用对体外缺氧条件下纯化培养的rgcs的实验研究

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1、中药血清的保护作用对体外缺氧条件下纯化培养的RGCs的实验研宄李颖邸红莲*保定市第一屮心医院071000摘要：A的探讨补肾活血屮药血淸对体外缺氧条件下纯化培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用及其机制。方法选取出生Id的新生乳鼠30只，采用“两步筛选法”纯化培养SD新生乳鼠视网膜神经节细胞(RGCs)，选取出生7d的SD大鼠6只，采用“改进的酶消化法”纯化培养新生SD大鼠视网膜Muller细胞，然后按照1:25的比例将RGCs接种于被视网膜Muller细胞包被的培养基屮建立共同培养模型，在体外培养基屮分别加入葡萄糖(50mmol?L-l)和连二亚硫酸钠(1.0mmol?L

2、-l)(高糖缺氧组)；仅加入葡萄糖(50mmol?L-l)(高糖组)；加入连二亚硫酸钠(1.0mmol?L-l)(缺氧组)；在上述基础分别加入制定好的20%体积分数的补肾活血屮药血清进行干预，分别测定24、48、72h培养模型外液屮的乳酸脱氢酶(LDH)漏出量和谷氨酰胺合成酶(GS)活性。结果补肾活血屮药可以明显降低高糖、缺氧条件下RGCs细胞LDH漏出量及提高视网膜Muller细胞GS活性结论高糖或缺氧条件下可以造成RGCs、视网膜Muller细胞的细胞膜稳定性变差，通透性増加，补肾活血屮药可以改善细胞膜的稳定性，提高GS的活性，从而达到保护RGCs细胞的目的。关键词：补肾活

3、血屮药；缺氧；视网膜神经节细胞；视网膜Muller细胞【中图分类号】R285【文献标识码】A1材料与方法1.1实验动物视网膜Muller细胞实验动物：选取健康标准出生7d试验SD大鼠6只，不限雌雄，双眼未睁，符合国家医用动物一级试验标准，清洁级。由湖北屮医药人学动物实验室提供(动物许可证号：HB2004013),饲养环境安静，12h光照，环境温度20〜25°C,湿度：55%〜75%。RGCs细胞实验动物：选取出生Id的SD新生乳鼠30只，不限雌雄，符合国家医用动物一级试验标准，清洁级。由湖北中医药人学动物实验室提供（动物许可证号：HB2004027）。补肾活血中药血清实验动物:

4、标准实验用SD大鼠8〜12只，体重150〜180g,不限雌雄，符合国家医用动物一级试验标准，清洁级，采用全价鼠颗粒饲料。由湖北中医药大学动物实验室提供（动物许可证号：HB2004027）。1.2实验仪器与药品胎牛血清（北京基尼亚生物技术有限公司），胰蛋白酶（上海甄准生物科技有限公司），DF12培养基（南京奥多福尼生物科技有限公司），PBS（上海博谷生物科技有限公司），青霉素钠盐（上海远慕生物科技有限公司），硫酸链霉素（上海远慕生物科技有限公司），碳酸氢钠（分析纯）（上海榕柏生物技术有限公司），醋酸（分析纯）（上海榕柏生物技术有限公司厂），D-葡萄糖（上海远慕生物科技有限公司），

5、连二亚硫酸钠（分析纯）（上海远慕生物科技有限公司），小鼠抗大鼠SIRP—α单克隆抗体（ab34011，美国），小鼠抗大鼠Thy-l.l（克隆号：OX-7）Chemicon（美国），乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），K2045型台式多功能离心机（上海赛弗生物科技有限公司），美国精骐CO2恒温培养箱PYC-16（美国精骐右限公司），96孔细胞培养板（上海凌初环保仪器有限公司），低温冰箱（-20°C）（海尔），奥林巴斯光学相差显微镜CKX41（日本OL/MPUS公司），AB265-S电子天平（十万分之一，美国梅特勒公司），DGG-9240A电热恒

6、温鼓风干燥箱（上海巴玖实业有限公司），S433D全自动氨基酸分析仪（德国Sykam公司）1.3实验方法对补肾活血中药血清实验动物组的SD大鼠使用中药或生理盐水灌胃7d后，采用体外两步法纯化培养SD乳鼠的视网膜神经节细胞，用免疫荧光染色法对培养的视网膜神经节细胞进行鉴定及补肾活血中药血清制备具体步骤参考文献，将视网膜神经节细胞置于培养板中培养72h后分为正常对照组、缺氧组、正常中药干预组、缺氧中药干预组，分别于培养后24、48、72h测定各组细胞外液中Glu及Gly的浓度和各组细胞培养上清液LDH的漏出量。1.4实验分组方法将按照1:25比例培养好的细胞置于37°C5%CO2培养

7、基中24h后，去掉含奋20%胎牛血清的改良伊格尔培养基和Ham’sF12细胞培养基按照1:1比例混合（DF12），换用无血清的DF12培养液培养24h,去掉无血清培养液，按照下列分组情况进行分组，并分别将每组细胞分为24h、48h、72h培养组。测定三个时点的相关指标。正常对照组：含20%正常SD大鼠血清的DF12液。中药干预正常组：含20%中药SD大鼠血清的DF12液。高糖组：含20%正常SD人鼠血清的DF12液+终浓度为50mmol?L-l的葡萄中药干预高糖组:含20%中药S