置换型核酸适体电化学传感器的设计与ATP检测应用

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1、分类号：TS207.3学号：201500370049硕士学位论文置换型核酸适体电化学传感器的设计与ATP检测应用DesignofDisplacement-basedElectrochemicalAptamerSensorsandApplicationofATPDetection研究生姓名：陶灿灿指导教师：张资平副教授学科门类：农学专业名称：农产品加工及贮藏工程论文提交日期：2018年4月1日摘要研究和发展快速、高灵敏与高选择性的分析方法是食品质量与安全检测领域的重要课题，以核酸适配体探针为识别元素的电化学传感器是该研究领域的前

2、沿和重点发展方向之一。置换型核酸适配体电化学传感器以“适配体-互补DNA（aptamer-cDNA）”复合探针为识别元素，通过链置换分子识别反应引发的电信号对目标分子进行定量分析。此类传感器具有设计简便、灵敏度高和选择性好的优点，在食品安全检测中具有广泛的应用潜力。目前，大量的研究注意力集中于传感器灵敏度的增强，很少有研究工作关注传感器响应速率的提升。本论文针对传统置换型核酸适配体传感器普遍存在的响应速率慢的缺点，从合理设计aptamer-cDNA复合探针结构来探索这一问题的解决方案。论文借助超分子化学的“协同结合”概念，以三磷酸

3、腺苷（ATP）为模型分析物，分别设计了可对目标分子产生快速链置换分子识别的“三链协同稳定核酸适配体”和“双链协同稳定核酸适配体”探针，以此为基础构建了响应速度快、灵敏度高和选择性好的置换型核酸适配体电化学传感器。论文的具体研究内容和研究结果如下：（1）三链协同互补核酸适配体探针的设计及ATP检测应用。置换型核酸适配体电化学传感器对目标分子响应速度慢的主要原因是aptamer-cDNA复合探针中适配体链中的大部分碱基与互补DNA（cDNA）互补配对，阻碍了核酸适配体链与目标分子的快速结合。为了提高此类传感器的响应速度，本文第二部分提

4、出一种三链协同互补的复合探针设计方案。在此方案中，cDNA链是由20个T碱基的连接臂（T20）的两端分别连接两段短互补片段组成，这样一条cDNA链可同时与电极表面的两条核酸适配体链杂交而形成“三链协同互补”的aptamer-cDNA复合探针。这种三链协同互补复合探针一方面可以减少核酸适配体链中参与配对的碱基数目而提高传感器的响应速度，另一方面该结构具有较高的结构稳定性而增强传感器的信号灵敏度。实验分别探究了互补DNA链中的互补碱基数目、方波伏安法的测试频率及适配体探针在电极上的固定密度对传感器信号增益的影响，并得出：在最佳实验条件

5、下传感器用于检测ATP浓度的线性方程为Y=1.3541C+3.7027（R2=0.9977），线性范围为75倍（1~75nM），传感器对目标分子的检测时间为4分钟；传感器在复杂的混合物中对目标分子具有特异性的识别作用；同时在实际样品的加标回收实验中测得回收率达到95%以上。这充分表明三链协同互补探针结构的设计方案有效提高了传感器的响应速度和灵敏度，同时对目标分子ATP具有良好的选择性和特异性和应用于I实际样品检测中的准确性。（2）双链协同互补的核酸适配体探针的设计与ATP检测应用。论文第三部分介绍的双链协同互补探针结构是指在适配体

6、的底端增加额外的碱基，然后与其互补链进行杂交形成双链协同互补探针结构。这种双链协同结构降低了适配体与目标分子结合时的空间位阻，使目标分子ATP快速将双链解开完成链的置换识别反应，有效提高了传感器的响应速率和灵敏度。而且双链协同互补探针结构相对于三链协同结构而言，实验过程更简单、方便，无需严格控制电极表面核酸适配体探针之间的距离。传感器在最佳条件下的检测性能：传感器用于检测ATP浓度的线性方程为Y=0.9582C+1.3868（R2=0.9977），线性范围为100倍（1~100nM），传感器对ATP的检测时间为5分钟；传感器在复杂

7、的混合物中对目标分子具有特异性的识别作用；同时在实际样品的加标回收实验中测得回收率达到95%以上。这也充分表明双链协同互补探针结构的设计方案有效提高了传感器的响应速度和灵敏度，同时对目标分子ATP具有良好的选择性和特异性和应用于实际样品检测中的准确性。关键词：核酸适配体；协同互补；链置换反应；电化学传感器；响应速度；IIAbstractResearchanddevelopmentofrapid,highlysensitiveandhighlyselectiveanalyticalmethodsareimportanttopicsi

8、nthefieldoffoodqualityandsafetydetection.Aptamerprobeasrecognitionelementsofelectrochemicalsensorisafrontierofthestudyandone