三种荧光定量pcr检测方法比较

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1、WORD资料下载可编辑三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：(1)SYBRGreenI检测模式SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长

2、最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。SYBRGreenI的缺点：由于SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBRGreenI的优点：SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链 DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。(2)水解探针模式(taqman探针)TaqMan探针

3、是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的专业资料整理分享WORD资料下载可编辑5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94℃～60℃40个循环。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一种呈发夹结构的茎环双

4、标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，

5、发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM，TexasRed。PCR扩增程序通常是：94～55～72℃三步法，40个循环。专业资料整理分享WORD资料下载可编辑FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5`端标记FAM荧光基团，另一探针的3`端标记Red640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发

6、光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。专业资料整理分享WORD资料下载可编辑能用于实时荧光PCR定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：专业资料整理分享WORD资料下载可编辑实验中的一些好习惯：加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。防止RNA酶

7、污染的措施：1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员