新生鼠视网膜中tgf-β1表达的影响研究

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1、新生鼠视网膜中TGF-01表达的影响研宄兰兰1惠延年2(1河南科技大学第一附属医院眼科河南洛阳471003;2丙京医院眼科陕丙丙安710032)【中图分类号】R774【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)32-0031-03【摘要】目的比较TGF-βl在不同氧环境饲养新生鼠视网膜中的表达变化，揭示TGF-βl与早产儿视网膜病变发病的关系。方法60只7hl龄C57BL/6J鼠仔随机分为三组，对照组饲养于空气中；实验组1饲养于75%氧箱中5天后改为空气饲养；实验组2氧箱中的氧浓度逐日从30%升高至

2、75%后再逐日下降至空气饲养。分别于第3、8、14天行视网膜铺片ADP染色观察视网膜血管变化；14天时采用免疫组化法检测视网膜TGF-βl表达，RT-PCR法检测TGF-βlmRNA表达。结果实验组1和实验组2新生鼠视网膜血管缩窄。第14天时，实验组1周边视网膜血管密度增加，TGF-βl表达呈阳性改变，TGF-βlmRNA表达高于对照组和实验组2(P>0.05)；实验组2周边视网膜血管未见明显异常改变，TGF-βl表达呈阴性改变，TGF-βlmRNA表达与对照组比较差

3、异无统计学意义(P<0.05)o结论TGF-βl参与早产儿视网膜病变的发病过程，吸入氧浓度波动较大时视网膜表达TGF-βl增加，并产生类似于早产儿视网膜病变的改变。【关键词】早产儿视网膜病变转化生长因子βl给氧方式视网膜血管引言早产儿视网膜病变(Retinopathyofprematurity，ROP)是早产低出生体重儿氧疗后出现的一种以视网膜血管发育异常和视网膜增殖性改变为主要表现的致盲眼病。近年来随着我国新生儿医学的快速发展，早产儿、低出生体重儿抢救存活率显著提高，ROP的发生率也相应增加，严

4、重影响早产儿的生存质量。木研究采用不同的给氧方式，对比观察TGF-βl在高氧环境饲养新生鼠视网膜中的表达改变，以期揭示ROP的发病机制，为进一步研究苏治疗措施提供依据。1材料和方法1.1材料孕鼠15只购自上海斯莱克实验动物冇限责任公司。二氨基联苯胺（北京中杉金桥公司）；TGF-βl兔抗鼠多克隆抗体和SP法免疫组化检测试剂盒（福建迈新生物公司）;RT-PCR实验试剂（美国Fermentas公司）。PCR引物由上海生工公司设计合成。1.2方法1.2.1实验动物及分组：冋日出生的清洁级7日龄C57BL/6」鼠仔60只（

5、雌雄不限）和母鼠9只。饲养于福建医科大学实验动物中心啮齿类SPF级实验室，饲养条件：温度22°C〜25°C，湿度50%〜70%，正常昼夜节律。实验分组见表1。1.2.2动物模型的制备：将实验动物称重统一编号后随机分为实验组及对照组。对照组饲养于空气中，实验组7dC57BL/6j鼠仔及其哺乳母鼠置人密闭的氧箱内，接100%湿润医用纯氧,调节气体流量0.5〜0.75L/min，每天3次（9:00,14:00,18:00）用测氧仪监测出气管中的氧浓度使其保持在0标氧浓度。表1实验分组1.2.3视网膜铺片ADP染色:对照组、实验组1和实验组

6、2分别于第3、8、14天各取3只新生鼠进行视网膜铺片，ADP酶法染色。具体方法如下：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速摘取眼球，置于4%多聚甲醛溶液4°C固定4h。手术显微镜下，将眼球以视乳头为中心做4-5个放射状切开，去除角膜、巩膜、脉络膜、视网膜色素上皮层。Tris马来酸缓冲液漂洗65min，37°C反应液中孵育15min。10%硫化铵反应5min。中性树胶封片观察。1.2.4SP免疫组化法检测视网膜中TGF-βl的表达：第14天吋取新生鼠视网膜包埋，石蜡切片经二甲苯脱蜡、水化，30mL/LH2O2溶液中室温下孵育30m

7、in，正常山羊血清37°C孵育lOmin，滴加TGF-βl兔抗鼠多克隆抗体，4°C过夜，滴加生物素化羊抗兔抗体，37°C孵育20min。加链霉菌生物素-过氧化物酶溶液，37°C孵育20min,DAB显色剂显色，苏木素复染，封片，光镜下观察。1.2.5视网膜脉络膜组织中TGF-βlmRNA的表达：第14天时取新生鼠视网膜脉络膜组织采用Trizol一步法提取总RNA,TGF-βl和β-Actin引物由上海生工公司设计合成。PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行灰度扫描，记录TGF-

8、βl及β-Actin的吸光度(A)值，计算TGF-βl/β-Actin的值。1.3统计学处理采用SPSS13.0软件包进行统计学处理，各组数据均采用X2表示，采用单因素方差分析，以P<0.