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《phbhox载血管内皮生长因子纳米球的制备及其体外性能》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、PHBHOx载血管内皮生长因子纳米球的制备及其体外性能 在组织工程中,生物活性生长因子可以促进其特定的种子细胞的增殖及分化,从而实现关节一体化各个区域的构建[1-4].但生长因子极易被体内的蛋白酶所分解,生物利用度低,不能有效发挥其生物学作用[5-7]. 为了解决这些问题,本课题组运用发酵技术开发出了一种新型多聚羟基烷酸-羟基丁酸与羟基辛酸共聚物(PHBHOx),不仅具有多聚羟基烷酸-羟基丁酸的通性[8-10],而且其柔韧性与加工性能得到较大改善[11-12]. 本课题制备PHBHOx载血管内皮生长因
2、子(vascularendothelialgroes;105Da,由本实验室发酵生产所得);VEGF(武汉博士得生物工程有限公司,中国);二氯甲烷(天津星马克科技发展有限公司,中国);聚乙烯醇(PVA,上海研生实业有限公司,中国). 1.1.2主要仪器磁力加热搅拌器(浙江金坛恒丰制造有限公司,中国);超声波细胞粉碎仪(宁波新艺超声设备有限公司,中国). 1.1.3实验动物9周龄乳兔1只,重量1000g,于山西医科大学实验动物中心,许可证号:SYXK(晋)2009-0004. 1.2方法 1.2.1载
3、VEGF纳米缓释微球的制备称取一定量的PHBHOx溶于2ml二氯甲烷(含5%Tu;gVEGF溶于0.5mlPBS液中作为溶液2,按3%的浓度秤取一定量的PVA溶于20ml蒸馏水中,加热搅拌溶解后,降至常温,作为溶液3.调节超声波细胞粉碎仪,输出功率为250199培养液冲洗并搜集滤过物,1200r/min离心5min,离心半径15.5cm,弃上清液,用0.1%Ⅳ型胶原酶(1g/L)37℃消化滤过物30min,离心,取积淀物用M199培养液(含体积分数20%胎牛血清,0.02mg/L血管内皮细胞生长因子,青、链
4、霉素各100U/ml)吹打匀称,细胞计数,以11010/L细胞浓度置于25ml培养瓶作原代培养,倒置显微镜下察看细胞状态.72h后首次换液,随后每隔48h换液,待细胞增殖融合至80%~90%时,以0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙胺四乙酸)消化传代,1∶2传至第3代备用. 1.2.3实验分组实验分组依据所含成分的不同分为3组.A组:VEGF组;B组:纳米微球组;C组:对照组.A组为单纯10%胎牛血清DMEM液+VEGF;B组将VEGF-P(HBHO)NPs加入10%胎牛血清DMEM液.C组为没有添加药物的
5、10%胎牛血清DMEM液(对照组). 前两组培养液中VEGF浓度分别设为10、20、50ng/ml3个浓度.提取培养至第3代的兔肾微血管内皮细胞,用培养液调整浓度至1107个/L,接种到96孔板上,每孔200μl.使细胞同步生长后,隔天换液1次,并于1、3、5、7、10d收集细胞,A、B两组每个时相点设置4个重复测量孔,C组每个时相点设置2个重复测量孔. 1.2.4MTT法检测缓释纳米微球对肾血管内皮细胞活力的影响分别于培养1、3、5、7、10d,常规先后加入5%四甲基偶氮唑盐(MTT)20&mu
6、;l,经过4h后再加入二甲基亚砜150μl,低速振荡,用酶联免疫检测仪依次测量各孔的吸光度值,检测波长为490nm,以反映VEGF对肾微血管内皮细胞活力的影响. 1.3统计学处理本研究所得数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,计数资料以x±s表示,采用t检验,计数资料采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1纳米微球及肾微血管内皮细胞形态的观察 纳米缓释微球表面形态,基本完整,大小较均一,分散性可;载药纳米微球的平均粒径为(524.75&pl
7、usmn;67.46)nm(图1).肾微血管内皮细胞呈短胖梭形,镶嵌分列,互不堆叠,产生接触抑制呈铺路鹅卵石形(图2). 2.2载VEGF缓释纳米微球载药量与包封率的测定结果 采用ELISA法在450nm波长处,测定某一标准孔的OD值,吸光度(A)与浓度(C)呈较好线性关系,回归方程为:A=0.002C+0.122,r²=0.997(表1、图3). 根据公式,载药量=(微球中所含药物重/微球的总重)100%;包封率=(系统中包封与未包封的总药量-液体介质中未包封的药量/系统中包封与未包封的
8、总药量)100%;得到载VEGF缓释纳米微球的载药量为:(1.257±0.024)10-3%,包封率为:(90.77±1.67)%(表2). 2.3PHBHOx载VEGF缓释纳米微球体外释药率的测定 精确称取10mg纳米粒分散于100mlpH7.4的PBS液中,水浴恒温37℃,并以一定的速度低速搅拌,分别在0、1、3、5、7、9、11、13、15d取样5ml,同时补充同体积的P
