dgat1基因k378n多态性与2型糖尿病及糖尿病肾病的关系

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1、DGAT1基因K378N多态性与2型糖尿病及糖尿病肾病的关系　　【Abstract】AIM:ToinvestigateorphismrelatestoChinesetype2diabetesmellitus（T2DM）anddiabeticnephropathy（DN）.METHODS:GeneK378NpolymorphismintheDGAT1geneplatedirecteddyeterminatorincorporationalcontrols.RESULTS:IntheT2DMgroup,therealcontrols（P&g

2、t;0.05）.Thereaynotbeassociatedellitus,type2；diabeticnephropathies；polymorphism,singlenucleotide；diacylglycerolacyltransferase1；templatedirecteddyeterminatorincorporationega公司.核酸外切酶I、虾碱性磷酸酶、AcycloDNA聚合酶和荧光偏振检测仪Victor2购自PerkinElmer公司.荧光标记终止子AcycloTerminatorsTM（AcycloGTPR11

3、0/AcycloCTPTAMRA）为PerkinElmer公司专利产品.DNA引物5′CACACCCCACCTACCTGATGC3′及5′CCTGGGGGCTGGGATGG3′；探针5′CTTCTGGCAGAACTGGAA3′由上海博亚生物技术有限公司合成.　　1.2方法　　1.2.1DNA引物及探针设计根据引物设计的基本原则，应用DNAStar软件，结合TDIFP反应的特殊要求设计引物及探针.引物与探针序列不能重叠，探针的3′末端必须紧邻待测变异基因位点.特异性寡核苷酸探针及与变异碱基对应互补末端掺入的特异碱基GTP/CTP是基于DG

4、AT1基因扩增片段内的序列及变异碱基设计的，扩增靶片段长度为140bp（Fig1）.　　1.2.2DNA的提取及PCR扩增用标准酚/氯仿法由周围血白细胞内提取基因组DNA.取DNA模板5μL，dNTP150μmol/L，引物各0.25μmol/L，MgCl22.0mmol/L,TaqDNA聚合酶16.67nkat，反应体系共25μl.PCR条件：95℃4min；94℃30s，52℃40s，72℃30s，40个循环；72℃5min，扩增靶片段DNA.标本DNA经扩增后所得产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳检测.将经回收、连接、转化、筛选、测序

5、正确的发生和未发生变异的质粒DNA作为阳性和阴性标准品.　　1.2.3DGAT1K378N基因多态性的检测鉴定采用TDIFP方法对扩增产物中K378N变异碱基进行检测.首先消化处理：虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ混合物与PCR产物37℃孵育2h，可分别降解PCR产物中残余的dNTPs和引物，避免对后续反应的干扰；而后80℃热处理15min灭活酶.以此产物为模板与探针结合，再以AcycloGTPR110和AcycloCTPTAMRA这两种荧光标记终止子为底物，在AcycloDNA聚合酶及其缓冲液中于95℃2min,然后95℃15s，50℃30

6、s，25个循环杂交延伸,最后15℃延伸10min，4℃保存.PCR产物模板与探针互补杂交，与模板互补的游离荧光标记终止子AcycloG/CTP掺入到探针末端，荧光素分子量增加，在荧光偏振检测仪上分别检测AcycloGTPR110（波长535nm）和AcycloCTPTAMRA（波长595nm）的荧光偏振（FP）值,据两种荧光的FP值,推断变异碱基类型.　　统计学处理：正态分布资料用x±s表示，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，组间均数比较采用t检验（方差不齐时用t′检验）或方差分析，疾病危险因素分析采用二分类Logistic回

7、归，整个统计分析用SSPS11.0软件处理.　　2结果　　2.1临床特征DN＋组和DN－与正常对照组的性别（Sex）、年龄(Age)、体质指数BMI，均无显著差异(P>0.05)，DN＋组和DN－的收缩压(SBP)及舒张压(DBP)水平高于正常对照组(P<0.05)，并且DN+组收缩压高于DN－组(P<0.05,Tab1).表1各组临床特征比较（略）　　2.2生化特征DN＋组和DN－与正常对照组的血胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白（HDL）等均无显著差异(P>0.05)，DN＋组和DN－组的TG水平高于正常对照组

8、(P<0.05,Tab2).表2各组生化指标特征比较（略）　　2.3反应体系及引物测试PCR扩增所有标本基因组DNA中DGAT1基因目的片断,显示扩增片段长度为140bp,无非特异扩增条带，与预期相符