实验12pcr实验1

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1、幻灯片1PCR技术幻灯片2一、聚合酶链式反应（PCR）概述（一）概念聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaciton,PCR），即PCR技术，是近年来发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。幻灯片3（二）发展历程1971年KjellKleppe提出PCR原始雏形概念1983年KaryMullis发明PCR技术1987年获得专利1993年诺贝尔化学奖幻灯片4二、PCR反应的原理和步骤PGR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的暮核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成：幻灯片5DNA复制幻灯片6二、PCR反

2、应的原理和步骤PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成：幻灯片71、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；幻灯片8•退火温度与退火时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物的退火温度可通过以下公式帮助选择：•Tm值懈链温度）=4（G+C）

3、+2（A+T>•退火温度^⑴值-（5〜10°C）幻灯片93、引物的延伸：DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性~退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的片段富集106〜109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。幻灯片10PCR的基本步骤重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩増100万倍以上DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍DNA单链与引物复性D

4、NA双螺旋幻灯片11四、PCR反应体系的主要成分和作用•DNA聚合酶•模板•引物參dNTP•缓冲体系幻灯片12（一）DNA聚合酶与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活TaqDNA聚合酶来源于嗜热水生菌性。可分为两大类：1、具有校正功能的（有3’一5’核酸酶活性）比如：Vent,pfu，pwo等2、不具有校正功能的（无3’一5’核酸酶活性）比如：一般的TaqDNA聚合酶幻灯片13（二）模板核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质

5、使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸狐或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。幻灯片14（三）引物弓I物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。幻灯片15设计引物应遵循以下原则：1、引物长度一般15-30个bp，常用为20bp左右。引物过短过长都会使特异性降低。2、引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3、引物碱基G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，

6、G+C过多易出现非特异条带。4、避兔引物内部出现二级结构，避兔两条引物间互补，特别是3•端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。幻灯片165、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。6、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。幻灯片17（四）dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，dNTP应为50〜200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（

7、等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏髙或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。幻灯片18（五）PCR反应缓冲液组成：50mMKC110mMTris.Cl（pH8.4）1.5mMMgC12Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。Mg2+浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。幻灯片19六、PCR的反应条件控制（一）PCR反应的温度和时间控制1、变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的