实验7小鼠腹水瘤细胞裂解及乳酸脱氢酶活性检测

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1、实验7小鼠腹水瘤细胞裂解及乳酸脱氢酶活性检测姓名：李思露学号：131140040一、实验目的1.了解裂解细胞的意义。2.了解及掌握哺乳动物细胞常川裂解方法及裂解效果检测方法。二、实验原理反冻融、超声及去污剂处理均可导致细胞裂解。不同细胞裂解方法所产生的裂解效果及对细胞蛋白活性的影响不M。细胞裂解效果可通过形态学方法及胞内标志蛋白活性反映。乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)为胞浆标忐酪，稳定存4■:于几乎所科细胞的胞浆内。细胞脱破坏活，LDH即被释放到细胞外。定:W:检测细胞悬液离心P上淸液屮乳酸脱氢酶的活性即可反映

2、细胞膜破碎的程度及对胞浆蛋G活性的影响。LDH检测原理：LDH催化底物形成可与兄色剂反应生成有色化合物的产物，通过比色可显示酶活。三、实验材料、试剂及器材(一)材料：接瘤7天的荷腹水瘤小鼠。(二)试剂：1.0.01mol/L,pH7.2PBS。2.碧云天RTPA裂解液(强)。3.1%TritonX-100溶液：用PBS配制。4.乳酸脱氢酶(LDH)测试盒。(三)用品:普通台式离心机、-20°C低温冰箱、10mL刻度离心管、胶头吸管、C02培养筘、％孔板离心机、96孔板、100UL枪及对应枪头等。四、实验操作1.准备腹水瘤细胞：抽出荷瘤小鼠腹水

3、，用PBS将细胞浓度调整为1.0X106/mL。2.细胞裂解：(1)冻融:1.5mLEP管,0.5mL细胞悬液，-2(TC冰箱及37'C水浴中反复冻融5次。(2)去污剂处理：0.5mL细胞悬液；1500r/min离心8min,奸上淸。然后分別作如下处理：处理1:0.5mLPBS重悬细胞处理2:0.5mLRIPA裂解液重悬细胞，置4°C冰箱，分别在10、20、30min时取样制备装j观察细胞完整度。处理3:1%TritonX-100溶液重悬细胞，4°C静置30min3.LDH活性测定(1)离心收集上清:12000r/min离心5min,小心转移

4、上清到干净的EP管。(2)反应：96孔细胞培养板内进行如下反应：a.20PL待测标本+25uL基质缓冲液+5uL辅酶I,37°C温育15min；b.+2,4二硝基苯肼25PL,37°C温育15mina.+0.4mol/L氢氧化钠250uL,室温5min五、(1)测定吸光值:450nm测定0D。实验结果1.0.5mLRTPA裂解液軍:悬细胞，置4'C冰箱，在10分钟时取样制备装片观察细胞完整度，在显微镜下观察到的视野如下阁所示。图1RIPA裂解液重姑细胞，s:rc冰筘，许10分钟时观察到的细胞完整度2.LDH活性测定时加入0.4mol/L鉍氧化

5、钠250pL后在96孔板屮的反应。罔2LDH活性测定吋加入氢氣化钠后在96孔板屮细胞恳液变成棕祸色3.450nni测吸光位0D位的结果。姓名编号123李思露APBSTritonX-100溶液RIPA裂解液林静文BPBSTritonX-100溶液RIPA裂解液Rawdatareport01/01x200000:41:49Lab.name:Bio-RadLaboratorieskitnan.iG:Endpciin七#01Readingmode•SingleMeasurementFilter：450nm：2)ABCDEFGH5890.4940.54

6、05570.4650.5260540.0680.0400570.0470.0450450.0490.Q450520.0460.071,0550.0690.079□500.0490.0781234560.0360.0580.0440.0300.0380.0420.0400.0320.0440.0550.0630.0870.0490.0500.0580.0510.0460.0700.0550.0410.0700.0500.0610.086阁3450nm测吸光值0D值的结果六、作业与思考题比较经PBS、RIPA裂解液、TritonX-100溶液处理

7、后,LDH活性测定值的大小，査阅资料并解释。答：本组实验结果为,PBS的0D值为0.589和0.557,TritonX-100的0D值为0.494和0.465,RIPA裂解液的0D值为0.540和0.526。下通过单因素方差分析假设检验。假设检验为：Ho：uI=u2=u3(三种处理方式对细胞裂解无影响)H,：yku2>P3不全相等(三种处理方式对细胞裂解不同或不全相同)PBS处理TritonX-100处理RIPA裂解液处理0.5890.4940.5400.5570.4650.526ni222均数0.5730.47950.533单因素方差分析衣

8、误差来源(Source)平方和(SS)自由度(df)均方(MS)检验统计量(F)处理效应SSA=O.0088032MSA=O.004401512.8136827误差