医学论文《edta微波脱钙骨的免疫组化染色》

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1、医学论文《EDTA微波脱钙骨的免疫组化染色》-->EDTA微波脱钙骨的免疫组化染色提　要:目的　改进传统骨组织的脱钙方法,改善免疫组化效果。方法　采用20%EDTA微波脱钙法对兔骨组织进行脱钙。结果　EDTA微波脱钙法能够更好的保持骨组织结构和组织中的抗原物质,得到更好的免疫组化切片。结论　EDTA微波脱钙法优于传统脱钙法,更适合于骨组织脱钙和免疫组化制片。关键词:EDTA;骨;免疫组化在病理技术中,骨组织的脱钙处理是一大技术难点,因而要顺利制出一张质量较佳的骨组织切片,特别是做出一张质量上乘的免疫组化的骨组织切片,并非易事。传统的脱钙方法,多采用酸性溶液,

2、极易使组织酸化,影响细胞核着色,且时间较长,对组织有一定的破坏性,从而影响病理学的诊断和研究。查阅了有关中外文献,结合自己的实际工作情况,不断摸索,积累了一定的经验,现就骨组织脱钙与免疫组化方法简述如下。1　材料与方法1•1　材料　　健康大耳白兔42只,体重2•5~30kg(附属大坪医院野战外科研究所动物中心提供)。3%的戊巴比妥钠耳静脉麻醉(30mg/kg),无菌条件下,环形切断桡骨中断骨膜,用牙科磨钻于局部横行离断桡骨。确定应用血管内皮生长因子(VEGF)对骨折愈合的作用;了解VEGF及其受体在骨折愈合过程中的表达及规律。伤后3周

3、,将动物按各时相点断颈处死,迅速取下兔左上肢置于冰盒上,以桡骨骨折端为中心切取骨折端标本全长约1•5cm。将冷冻切片标本置于4%多聚甲醛中固定4~6h,取出后在20%EDTA溶液中微波下脱钙[1~3],完成后标本置于-70℃保存备用;制作石蜡切片标本放入12%甲醛中固定24h后移入20%EDTA溶液中微波下脱钙。EDTA由成都化学试剂厂生产。1•2　脱钙液的配制　　EDTA(乙二胺四乙酸二钠)20g,双蒸水100ml,加NaOH充分搅拌溶解后,用1mol/LHCl调pH至7•3~7•5(pH7•5时

4、EDTA较易溶解)。1•3　脱钙方法　　将1•5cm×1cm×0•5cm的骨组织放入微波炉专用盒,根据组织的多少放入适量的脱钙液,在微波下50℃间歇脱钙,以每次辐射2min为一脱钙循环,经过反复筛选以30个脱钙循环为最佳脱钙终点。在2个循环之间将标本盒取出微波炉外,室温冷却5min,以保证每次辐射中脱钙液温度不高于70℃[4]。常规骨组织脱钙多采用酸性溶液,对组织细胞有一定的破坏性,细胞核不易着色,也容易破坏抗原物质;而用EDTA脱钙液加微波辐射进行脱钙,不仅能完好保持组织的完整结构也能很好保存组织中的抗原物质。1R

5、26;4　免疫组织化学方法　　骨组织固定、脱钙后,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、用美国产AO切片机将骨组织切成5μm厚的连续切片,裱片后入常规烤片、脱蜡至水,一部分作HE染色,一部分按S-P(链霉菌抗生素蛋白过氧化物酶)法进行检测。步骤如下:(1)30%过氧化氢孵育15min,清除内源性过氧化物酶的活性。(2)蒸馏水冲洗,0•01mol/LPBS浸泡5min×3次。(3)滴加1%胃蛋白酶孵育10min。(4)0•01mol/LPBS浸泡5min×3次。(5)5%正常山羊血清(PBS稀释)室温10min。(6)倾去血清,滴加30μl按一定

6、倍数稀释的一抗(1∶200),4℃过液。(7)0•01mol/LPBS浸泡5min×3次。(8)滴加生物素标记的二抗(1∶150)30μl,37℃孵育30min。(9)0•01mol/LPBS浸泡5min×3次。(10)辣根酶标记的链霉卵白素(1∶150)30μl,37℃孵育30min。(11)0•01mol/LPBS浸泡5min×3次。(12)DAB显色5min。(13)自来水充分水洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,DPX封片。2　结果　　脱钙时间:EDTA脱钙液中的骨组织在微波炉辐射下需要约30个脱钙循环(每个脱钙循环2m

7、in),即每天微波下脱钙总计约1h,5d后骨组织脱钙完毕,以针灸用体针能顺利刺入骨组织为脱钙终点。制片质量:脱钙后的骨组织均能切出较好的连续切片。骨折端切片连接很好,无裂开、破碎现象。镜下观察:HE骨细胞,软骨细胞、特别是骨折断端形成的骨痂以及骨折后破骨细胞在髓腔侧的聚集与骨的重建等组织细胞的形态结构染色很清晰,见图1。细胞核和细胞质色彩鲜艳,对比度强,核染色质显示清楚。免疫组织化学染色能理想的显示抗原物质,VGEF免疫组化阳性反应物为棕黄色,见图2,定位明确,组织切片背景干净。而采用酸性溶液脱钙,极易使组织酸化,影响细胞核着色,且时间较长,对组织有一定的破

8、坏性,见图3。3　讨论　　实验骨组织骨折端的切片制作