胃癌细胞中dpc4基因失活与启动子区的突变

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1、胃癌细胞中DPC4基因失活与启动子区的突变【】目的研究胃癌细胞系中dpc4基因表达和启动子区域的突变情况，并分析了两者之间的关系。方法采用rtpcr法检测9种胃癌细胞系中dpc4基因的表达情况；克隆和测序dpc4启动子区域的突变情况；应用tfsearchver.1.3软件分析dpc4启动子区域的转录因子结合位点。结果dpc4在snu5、snu16、snu484、snu638和katoⅲ细胞中表达较高，而在snu216、mkn28、mkn74和ags细胞中表达较低或缺失。测序结果表明，mkn74细胞dpc4启动子区

2、域出现了两处碱基置换突变，而在其它8种细胞系中没有发现突变。两处突变可能会影响转录因子mzf1和ik2与dpc4启动子的结合。结论dpc4基因在胃癌中频繁发生失活，而其启动子区域的突变可能是导致其失活的原因之一。【关键词】dpc4胃癌启动子突变0引言胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居消化道肿瘤的首位[1]。目前，随着分子病理学的发展，许多基因，如tp53、kras、cerbb2、ksam、ecadherin(cdh1)和pten，已被发现与胃癌的发生和发展过程密切相关[23]。.133229.然而，研

3、究表明这些基因的改变并不能完全说明胃癌的演进过程，与胃癌相关的且未被阐明的分子事件还很多。最近，有文献报道，位于18号染色体的dpc4（deletedinpancreaticcarcinoma4,dpc4）基因可能在胃癌的发生发展过程中扮演着非常重要的角色[4]。dpc4基因所编码的蛋白（smad4）是tgfβ（transforminggroad4蛋白在细胞浆内与磷酸化的受体型smad蛋白,即smad2和smad3，形成异源三聚体复合物，然后从胞浆穿梭入细胞核。此复合物在细胞核内作为转录因子调节tgfβ靶基因的表

4、达，其中包括细胞周期蛋白依赖的激酶抑制基因（cyclindependentkinaseinhibitors）p15(ink4b)和p21(kn28和mkn74）和一种印戒细胞癌的细胞系（katoⅲ），所有细胞均由韩国首尔大学药学院申英基教授馈赠。snu5和snu16细胞为悬浮生长的细胞系，其余为贴壁生长的细胞系。细胞接种在含10%胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640培养液中，在37℃，5%co2环境下培养。1.2核酸提取采用基因组dna提取试剂盒（qiagen,

5、germany）来提取9种传接5代以内的细胞系基因组dna，所有的操作步骤完全参照试剂盒说明书的进行。提取的dna首先要经过琼脂糖凝胶电泳来检测是否有降解成分，合格的再经过紫外分光光度计检测其含量和质量，od值260nm/280nm在1.8到2.0之间的为质量合格。此外，我们用trizol（invitrogen,usa）试剂从细胞系中提取rna，然后利用superscriptⅱ转录酶、寡核苷酸dt以及随机引物与rna共孵育来进行反转录。整个操作过程完全按照产品说明书执行。1.3反转录聚合酶链反应(reverset

6、ranscriptionpcr,rtpcr)采用rtpcr的方法来检测9种胃癌细胞系中dpc4基因在rna水平的表达情况。具体的引物序列如下：正义引物5′atggacaatatgtctatta3′，反义引物5′gtctaaaggttgtgggtc3′，其扩增片断为dpc4基因编码区cdna的全长。pcr反应的条件是：94℃变性5min，紧接着28个循环的94℃变性30sec，60℃退火45sec和72℃延伸90sec，最后是72℃10min延伸步骤。pcr反应混合物的成分包括：1×缓冲液，1.5mmmgcl2，1

7、0pmol双向引物，0.2mmdntp，1utaqdna聚合酶，cdna和相应的双蒸水，反应混合物的总体积为50μl，阴性对照为无模版的pcr反应。最后利用浓度为1%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）对pcr产物进行电泳。所获得的凝胶图像用alaphaimager2200凝胶分析软件进行分析。1.4pcr扩增和测序为了检测胃癌细胞中dpc4基因启动子区的突变情况，我们对9种胃癌细胞系的该区域进行了pcr扩增。具体的引物序列如下：正义引物5′ccaggggtaagagaacacca3′，反义引物5′gacatggcgcg

8、gttacct3′，其扩增片断长度为1438bp。pcr反应的条件是：94℃变性5min，紧接着40个循环的94℃变性30sec，60℃退火45sec和72℃延伸60sec，最后是72℃10min延伸步骤。pcr反应混合物的成分同上，模板为100ng基因组dna，反应混合物的总体积为50μl。扩增产物首先经过1%琼脂糖凝胶电泳来检测是否有正确条带产生，然后利用试剂盒纯化扩