红球菌共代谢单氯苯甲酸及固定化细胞的研究

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1、红球菌共代谢单氯苯甲酸及固定化细胞的研究齐云投稿日期：2006-06-28作者简介：齐云（1977-），女，汉，河北联系方式：电话：022－89845241；Email:qiyun2008@yahoo.com.cn，赵林和谭欣(天津大学，环境科学与工程学院，天津，300072)文摘:氯代苯甲酸广泛应用于工农业生产中，导致了其大量释放到环境中。同时，做为模式化合物用于研究氯代芳香化合物的生物降解及阐述氯代化合物生物脱氯的策略。作者自天津农药厂污水处理系统的活性污泥中分离纯化出高效降解3－氯苯甲酸的细菌。经鉴定

2、将其归为红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)。该菌能在10-30°C温度范围以3-氯代苯甲酸为唯一碳源和能源生长，将苯环上的有机氯完全释放出来。由于该菌有广泛的温度适应性，尤其是能在10°C低温情况下利用底物，这对于低温地区生物修复有重要意义，在低温地域有很广泛的应用前景。但该菌缺乏独立分解2-或4-氯代苯甲酸的酶系。在以葡萄糖为外加碳源的条件下，菌株可以共代谢降解2-氯苯甲酸，但不能分解4-氯苯甲酸。研究了以聚乙烯醇(PVA),海藻酸钠，壳聚糖为载体时，固定化细菌的效果。结果表明，

3、单以PVA为载体时，固定化细胞不能成球性；以海藻酸钠为载体时，固定化细胞强度不足，培养一定时间后大部分菌球破裂；在海藻酸钠溶液中混入适量的PVA或壳聚糖都可大幅度提高固定化细胞的强度和韧性。关键词：氯苯甲酸；生物降解；共代谢；固定化氯代苯甲酸(chlorobenzoate,CBA)作为有机合成中间体或直接作为农药、除草剂、防腐剂等而在工业中得到广泛应用[1]。据报道，氯代苯甲酸是多氯联苯(PCB)完全降解的限速步骤[2]。由于氯原子的引入，导致了苯环结构发生改变，使得氯代苯甲酸的生物降解性能大大降低，同时，

4、由于氯代苯甲酸有较好的水溶性，容易进入自然环境，对人体健康造成严重的影响，对生态系统构成威胁。因此在水体净化和土壤修复过程中，氯代苯甲酸的无害化处理是必不可少的。共代谢是微生物对有机物作用的一种方式,现在对微生物共代谢作用一般定义为：只有在初级能源物质存在时，才能进行的有机化合物的生物降解过程,13--在这一过程中，微生物体依赖初级基质的消耗而生长，同时具有降解不可利用碳源和能源物质的能力[3]。工业废水中含有大量人工合成的污染物，按照传统的方法很难降解。同时在又中存在众多营养物质，因此微生物菌群可以通过共

5、代谢降解难降解或本身不能降解的污染物。研究某一高效菌株对特定有机物在共基质的条件下的降解不仅为生物处理污水技术提供理论依据，而且对实际水处理工程具有指导意义。目前,国外已将氯代苯甲酸作为模式化合物用以研究氯代芳香化合物的生物降解以及阐述微生物脱氯的策略[4]。但是国内对该化合物的生物降解性能研究还非常的少，并且缺乏对同类有机物共代谢降解等方面的研究。因此，开展生物降解氯代苯甲酸的研究就显得尤为重要。1.材料与方法1.1菌株来源活性污泥采自天津市农药股份有限公司污水处理车间。活性污泥处理后进行富集培养，通过纯

6、种分离得到高效分解菌株，命名为S－7。1.2培养基基本培养基(MM)采用Kozlovsky等人方法[5]。加入200mg/L3-氯代苯甲酸(3-CBA，Sigma-Aldrich,USA)做为唯一碳源和能源。1.3形态观察及生理生化特性生理生化特性参照《伯杰系统细菌学鉴定手册》[6]。1.416SrRNA基因扩增及序列测定将纯培养的菌株接入10µl灭菌水中，送至宝生物工程有限公司，测定16SrRNA基因序列，得到的1427bp序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST工具进行对比(http://

7、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，对比结果采用MEGAv.3软件分析发育树分析。1.5菌悬液的制备及培养条件菌悬液的制备：将菌株接种在营养培养基中培养24h，以12,000r/min离心10min，收集菌体，用灭菌后的无机盐培养基洗涤3次，重悬于10mL无机盐培养基中制成菌悬液。将菌悬液加入1000mL锥形瓶中，加入300mL灭菌的氯代苯甲酸无机盐培养液，使氯代苯甲酸的终浓度为200mg/L，在不同温度下，14013--rpm恒温摇床中振荡培养。每隔一定时间取样，立即测定菌体浓度．样

8、品以12,000r/min离心10min后，取上清液经0.22µm滤膜过滤，测定氯代苯甲酸、氯离子浓度。1.6分析方法3-氯代苯甲酸含量的测定：采用反相高压液相色谱(安捷仑1100，美国)，SupelcosiTMLC18色谱柱(5μm,250×4.6mm)，流动相为甲醇：0.25%乙酸＝58：42。进样量为20µl，流速为1mL/min，在235nm紫外检测。菌体生长测定：采用美国瓦里安紫外－可见分光光度计在55