southernnorthernwestern杂交应用

《southernnorthernwestern杂交应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。一、Southernblotting1.转膜当目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在0.4NNaOH碱性条件下变性，再在1.5MNaCl/lMTris(pH7.4)条件下中和使DNA仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的

2、DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过80°C处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。图4-2是通过毛细管渗吸法进行Southernblotting的经典装置图。玻璃板吸水纸2.分子杂交2.1预杂交将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程屮滤膜本身对探针的吸附。2.2杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。2.3洗膜经过一定的洗涤程序将

3、游离的探针分子除去。3.检测3.1放射性标记、检测在分子克隆操作屮用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P,33P和35S。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的u位磷酸整合到核酸链中，因此使用a位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如[a-32P]dATP。而在标记5’末端磷酸基团的反应中一般使用丫位磷酸被标记的分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Weste

4、rn杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。一、Southernblotting1.转膜当目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在0.4NNaOH碱性条件下变性，再在1.5MNaCl/lMTris(pH7.4)条件下中和使DNA仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过80°C处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。图4-2是通过毛细管渗吸法进行Southernblotting的经典装置图。玻璃板吸水纸2.分子杂交2.1预杂交将结合

5、了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程屮滤膜本身对探针的吸附。2.2杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。2.3洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。3.检测3.1放射性标记、检测在分子克隆操作屮用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P,33P和35S。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的u位磷酸整合到核酸链中，因此使

6、用a位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如[a-32P]dATP。而在标记5’末端磷酸基团的反应中一般使用丫位磷酸被标记的八TP。放射性的信号通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。3.2非放射性标记、检测。_其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛（digoxygenin，DIG）标记核酸探针。将DIG与dUTP交联，在参入核苷酸的标记反应中用DTG-11-dUTP（或DTG-11-UTP）取代dTTP（或rTTP）,使探针DNA或RNA分子被DIG标记。DIG标记的检测是该技术的核心，即利用抗DIG的抗体通过酶联免疫反应来完成。

7、将抗DIG的抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处，在加入显色剂BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/盐酸氮蓝四唑）后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置。图4-3是通过地高辛标记探针的Southern杂交实例。M,地高辛（DIG）标记的分子量标准（1DNA/////7dIII）；1-3,苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经—Pst＞凡11和你/?I酶切。以crylAa杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用

8、DIG标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。图4-3:通过地高辛标记探针的Southern杂交结果通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。S