microrna—146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应方法分析

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1、MicroRNA—146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应方法分析单位：276003山东省临沂，临沂市人民医院重症医学科（张建国、陈晓娟）;南昌大学第一附属医院重症医学科（丁成志、邵强、曾振国、刘芬、钱克俭）通信：钱克俭，Email：qkj0607sohu.microRNA是一类大小约22个核苷酸长度的内源性非编码小分子RNAsup/sup，主要通过识别并结合靶基因mRNA的3端非编码区，在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的降解sup/sup。有研究发现微小RNA参与肺内炎症反应的调控sup/sup，miR-146a是其中较有代表性的一个。本课题组前期研究发现，用LPS刺激肺泡巨噬

2、细胞，miR-146a的表达水平升高，并且升高程度与TNF-mRNA呈负相关sup/sup转染miR-146a能下调LPS诱导肺泡巨噬细胞TNF-的表达sup/sup，表明miR-146a能抑制LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。本实验拟进一步探讨miR-146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制，为体内试验提供理论依据。1材料和方法1.1材料大鼠肺泡巨噬细胞NR8383（上海中国科学院细胞库）;LPS（E.coli0111：B4）;Pre-miRTMmiR-146a前体、CyTM3标记的Pre-miRTM阴性对照（美国ABI公司）;大鼠TNF-ELISA检测试剂盒（上海森雄科技实业

3、有限公司）;PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR荧光染料试剂Ⅱ（SYBRPremixExTaqTMⅡ）PCR检测试剂盒（大连宝生物工程有限公司）;抗IRAK-1抗体，抗TRAF-6抗体、抗NF-Bp65抗体（美国abcam公司）。1.2实验分组及处理将体外培养的NR8383细胞按每孔1.5106个接种至6孔板，每孔2mL，每组2个复孔。转染组转染50nmol/L的Pre-miRTMmiR-146a前体，对照组转染50nmol/L的CyTM3标记的Pre-miRTM阴性对照，摇匀后继续培养24h，随后加入1g/mL终质量浓度的LPS处理细胞6h，离心收集细胞和上清液，-8

4、0℃保存。1.3检测指标及方法1.3.1免疫荧光法观察NF-Bp65核移位情况将细胞爬片放置于24孔板;甲醇丙酮固定细胞，0.5%TritonX-100PBS透化细胞;再放入含10%驴血清的PBS中4℃封闭;孵育一抗：用0.5%TritonX-100PBS稀释兔抗NF-Bp65（1∶50），常温下孵育4h后漂洗;孵育二抗：用10%驴血清的PBS稀释AlexaFlour488驴抗兔绿色荧光标记二抗（1∶200），室温下孵育20min后漂洗;用Dapi染核，滴加防荧光粹灭剂、固定封片，在OlympusIS71倒置荧光显微镜下拍照分析。1.3.2ELISA检测TNF-蛋白含量收集细胞

5、上清液，按照ELISA试剂盒操作说明书步骤操作检测TNF-蛋白含量。1.3.3RT-qPCR检测IRAK-1、TRAF-6及TNF-mRNA表达采用TRIzol法提取细胞内总RNA，通过紫外分光光度计测定总RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性及纯度。按照PrimeScript逆转录试剂盒说明书操作，所有操作均在冰上完成。10L的逆转录反应体系：PrimeScript缓冲液2L，PrimeScript逆转录酶复合物10.5L，多聚胸腺嘧啶引物0.5L，随机的6核苷酸引物0.5L，总RNA500ng，加无核酶水至总体积10L。反应条件：37℃15min，85℃5s。20L的

6、PCR反应体系包括：cDNA2L，上游引物0.8L，下游引物0.8L，SYBRPremixExTaqTMⅡ10L，ROXReferenceDye0.4L，无核酶水6L。反应条件：95℃30min，40个扩增循环（95℃5s，57℃20s，72℃27s）。选取-actin作为内参，检测IRAK-1mRNA、TRAF-6mRNA及TNF-mRNA的表达，相对表达量采用2-Ct计算。引物序列及长度见表1。1.3.4IRAK-1、TRAF-6、NF-Bp65蛋白表达收集细胞，离心，弃上清，提取总蛋白或分别提取胞核蛋白、浆蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。完成聚丙烯酰胺凝胶电泳（每孔加样20

7、L）、转膜、封闭，孵育一抗，兔抗IRAK-1（1∶2000）、兔抗TRAF-6（1∶1000）、兔抗NF-Bp65（1∶500）和鼠抗-actin（1∶3000）/兔抗LaminB1（1∶1000），4℃孵育过夜，漂洗3次;孵育二抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（1∶4000），37℃孵育1-2h，漂洗3次，暗室内曝光、显影并定影，行X胶片扫描，通过QuantityOne软件进行数据分析，检测IRAK-1、TRAF-6及胞浆NF-Bp65蛋白以-actin作为内参，细胞