膜片钳技术及其应用2010

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1、膜片钳技术与应用重庆医科大学儿童医院儿研所陈恒胜第一部分：膜片钳基础及原理第二部分：膜片钳实验系统组成第三部分：膜片钳实验基础第四部分：膜片钳的应用细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,kCa等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础

2、。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.如何研究离子通道对离子通道的研究主要从结构、功能以及结构与功能的关系三方面进行研究1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；X光绕射方法确定其三维立体结构。2.功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞

3、膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。3.结构和功能相结合：利用基因突变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得·阿格雷和罗德里克·麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本PPT的重点，可参考杨宝峰的≪离子通道药理学≫和Hill的≪IonicChannelsO

4、fExcitableMembranes≫..离子通道功能观察的两种技术对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术电压钳(Voltageclamp)技术膜片钳(patchclamp)技术电压钳技术(VoltageClamp)：电压钳技术，是20世纪初由Cole发明，Hodgkin和Huxley完善，其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依

5、据是电学中的欧姆定律，如膜的Na电导GNa与电化学驱动力（Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa=INa/（Em-ENa).因此可通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na,k,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析

6、。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。coleK+电流Na+电流电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化，

7、从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使Vm≠Vc,Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。指令电位（Vc)+_Vo电位记录电极（Vm)电流注入电极(I)电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点：1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆

8、流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一