膜片钳技术及其应用实例精要

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1、膜片钳技术及其应用实例王强1南京医科大学公共卫生学院神经毒理实验室内容提要离子通道膜片钳技术（PatchClampTechnique）应用实例2被引用次数13325一、离子通道细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科—电生理学（electrophysiology）。膜片钳技术已成为研究离子通道的“金标准”。4电压门控性离子通道：膜上通道蛋白的带点集团在膜电位改变时，在电场的作用下，

2、重新分布导致通道的关闭，同时有电荷移动，称为门控电流。配体门控离子通道：神经递质（如乙酰胆碱）、激素等与通道蛋白上的特定位点结合，引起蛋白构象的改变，导致通道的打开。机械门控离子通道：机械牵拉其他5二、膜片钳技术1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann在青蛙肌细胞上记录记录到ACh激活的单通道离子电流1980年Sigworth等用负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声1981年Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细胞记录技术1983年10月，《Single-C

3、hannelRecording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。6Neher(1944-)Sakmann(1942-)共获1991年诺贝尔奖8膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞，形成吉欧姆(GΩ)阻抗，使得与电极尖端开口处相接的细胞膜的膜片与周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。膜片钳技术的记录模式9全细胞膜片钳等效电流图1011膜片钳实验系统组成放大器转换器刺激器防震台显微镜微操纵器探头屏蔽网监视器EPC10Plus膜片钳放大器武汉华中科大仪博PC2C三、应用实例

4、生精细胞背根神经节神经元皮层神经元13神经毒理研究室是现代毒理学教育部重点实验室和江苏省应用毒理重点实验室的组成部分，在上世纪八九十年代就开始组建膜片钳实验室，属国内较早一批开展此工作的课题组，二十年来，在导师肖杭教授领导、全体研究生的共同努力下，现在这门技术已经成熟稳定，并得到国际国内同行的认可。14精子获能信号转导模式图应用实例一：生精细胞离子通道学研究小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流1、急性分离生精细胞机械分离法分离小鼠睾丸组织得到的细胞单酶消化法分离小鼠睾丸组织得到的细胞2、电极内液：CsMeSO3，CsF，EGTA，Mg2A

5、TP，Phosphocreatine，HEPES，调pH值至7.4，电极外液：NaCl,KCl,MgCl2,NaHCO3,NaH2PO4,D-glucose,HEPES,CaCl2，用NaOH调pH至7.43、全细胞膜片钳小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流小鼠生精细胞T型Ca2+电流密度曲线图Ca2+通道在-60mV时激活，电流在-30mV时达到最大值，翻转电位约为48mV，峰电流密度6.56±1.08pA·pF-1。(n=11)电压门控性钙离子通道的动力学研究激活（Activation）：用激活曲线反映通道开启的速度和难易程度Bolt

6、zmann方程拟和：gCa/gCamax={1+exp[-(Vm-V1/2)/K]}-1（gCamax峰电导的最大值，V1/2半数激活电压，K激活斜率因子）稳态失活（Steady-stateInactivation）反映通道失活数目的电压依赖性，用失活曲线表示ICa/ICamax={1+exp[(V-Vi1/2)/Ki]}-1（ICamax峰钙电流的最大值，V预刺激电压，Vi1/2半数失活电压，Ki失活斜率因子）复活（Recovery）用复活时间常数曲线表示单幂指数方程拟和ICa=Aexp(-t/r)+C（A起始时间，t为时间，

7、r为复活时间常数，C常数）失活曲线：分析细胞膜电位的变化引起失活离子通道数的变化。半数失活电(-60.790.24)mV，斜率因子(4.710.22)mV，在-90mV到-40mV通道失活。T型Ca2+通道激活和失活曲线图激活曲线：分析细胞膜电位的变化引起激活离子通道数的变化。半数激活电压(-49.430.62)mV，斜率因子(6.050.55)mV，在-65mV到-10mV通道开放。膜电位在-90mV，施加一组-80~+70mV，以10mV递增的、波宽为200ms的指令电压方波，以gCa与gCamax的比值对Vm作图，数据经B

8、oltzman方程拟和所得为激活曲线；以ICa与ICamax的比值对V作图，数据经Boltzman方程拟和即为失活曲线。小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征钳制电位为-90mV，