胆道闭锁外周血和肝脏treg细胞及foxp3表达水平及意义

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1、独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容

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3、肝纤维化和胆内外管闭锁为病理改变，其中肝外胆道闭锁最常见（占85%~90%）。据统计世界各国中以我国和日本发病率较高，女性高于男性，新生儿患病率为1：5000-18000，可见胆道闭锁患儿并非少见。目前手术治疗是唯一有效方法。手术时机宜在出生后2个月进行，据统计，黄疸消退率在生后40天内手术者达90%，70天内手术者为50%，超过120天手术者低于30%。若手术过晚尽管胆道闭锁患儿接受Kasai手术能够改善肝外胆道梗阻，但是仍可能发生进行性肝内胆管破坏和肝纤维化，以至80％患儿最终因肝硬化而须进行肝移植。可见BA的临床治疗效果不佳，原因

4、在于发病机制尚未能明确。至今为止关于胆道闭锁发病机制的研究一直不断。近年来的文献报道BA患儿胆管上皮异常表达HLA-DR抗原，肝内和肝外胆管均存在淋巴细胞浸润及T细胞受体(TCR)Vβ的T细胞寡克隆性扩增。在RRV诱导的鼠BA模型中，可诱导胆管特异性细胞和体液免疫应答。又有研究表明大剂量激素（免疫抑制剂）冲击治疗可有效缓解Kasai手术后出现的黄疸。这些均提示围产期病毒感染触发自身免疫应答是导致胆管损伤而发生胆道闭锁的重要原因。1995年Sakaguchi[1-2]等人首先在自身免疫性疾病相关实验中已证明，CD4+CD25+T细胞为具有

5、抑制功能的一群T细胞，称之为调节性T细胞（Treg细胞）。从此人们开始对调节性T细胞展开研究，他们发现Foxp3是Treg细胞的转录因子，是其重要标志，也是控制Treg细胞发育和功能的关键基因。调节性T细胞可显著抑6华中科技大学硕士学位论文制CD4+、CD8+T细胞的活化。研究发现去除此具有抑制功能T细胞或者使调节性T细胞失能后会导致许多自身免疫性疾病的发生。文献报道在如自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等人类多种自身免疫疾病中调节性T细胞存在数量和/或功能上存在异常。于是我们推想：既

6、然目前诸多研究者都认为BA最可能是一种自身免疫介导的疾病，那么胆道闭锁患儿体内调节性T细胞是否也存在数量和/或功能上的异常呢？是否胆道闭锁患儿体内调节性T细胞存在数量和/或功能上是降低的，从而导致强烈的CD4+、CD8+T细胞应答,并介导胆管损伤。本实验设计如下：收集胆道闭锁患儿外周血，采用流式细胞仪对其进行检测，以求得患儿体内外周血中CD4+CD25highT细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例，收集胆道闭锁和正常患儿肝脏用4%多聚甲醛固定和石蜡包埋后，采用免疫组织化学染色法测得肝脏中FoxP3+Tregs的表达以及

7、分布。对照组为先天性胆总管扩张症组和正常对照组，均排除其他自身免疫性疾病。本实验的目的在于探讨CD4+CD25+调节性T细胞与胆道闭锁的的相关性，以进一步证实胆道闭锁可能是一种自身免疫性疾病，从而为研究胆道闭锁发病机制寻求一条新路径。7华中科技大学硕士学位论文材料与方法1实验对象：本实验86例患儿为2007-9/2010-4月我院住院部患儿，18例胆道闭锁（其中7例女性，11例男性，平均月龄3.2月），并且经术中胆道造影和术后病理组织学（由两名专业病理医师报告）确诊为BA；29例为先天性胆总管囊状扩张症组（其中18例女性，11例男性，平

8、均月龄61.3月）；39例为正常对照（其中18例女性，21例男性，平均月龄2.9月）。所有研究对象均排除各种类型肝炎、其他自身免疫性疾病及病毒感染。抽取86例患儿静脉血各2ml，迅速用1g/L肝素钠抗凝剂抗