8种烈性中药的体外急性毒性试验方法初探

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1、8种烈性中药的体外急性毒性试验方法初探陈素珍李瑾翡（通讯作者）曾秋敏（广东省愈晶药晶检验所510180）【摘要】目的比较两种体外细胞毒性方法，探讨其用于预测中药急性毒性的可能性。方法应用3T3细胞中性红摄取实验、MTT实验检测8种烈性中药的细胞毒性，将测得的IC50值分别与急性经口毒性试验的小鼠LD50值进行比较。结果3T3细胞MTT、中性红2种检测方法中，以MTT法的检测结果与体内LD50的相关性较好。结论与3T3细胞中性红法相比，MTT法可较好地预测烈性中药的急性毒性，有望用于中药急性毒性的初筛实验。【中图分类号】R28【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013

2、）22-0044-02急性毒性试验是毒理学安全性评价的首个基础性工作，传统的急性毒性试验由于实验周期长、使用实验动物多，耗费人力物力大，越来越不能适应当前现状。且随着动物伦理和“3R”原则的贯彻实施，体外替代实验成为当今研宄工作的热点。己有研究表明，化学物质的体外细胞毒性实验与整体动物实验结果有很大的相关性，有望用于化学物质急性毒性筛查［1］。木研究旨在探讨体外细胞毒性方法用于预测中药急性毒性的可能性。1.材料与方法1.1试剂与仪器8种烈性中药受试物：附子、炮附片、牵牛子、山豆根、雷公藤、制草乌、姜半夏、苦楝皮中药配方颗粒均为由某有限公司提供。RPMI1640培养基（GIBCO公

3、司）;胎牛血清（杭州四季青）;MTT（广州威佳）；中性红染料（广州威佳）。M2E多功能酶标仪；OLYMPUS正置显微镜。1.2溶液配制进行动物实验吋，将受试物用打粉机打碎至细粉，加温纯化水不断研磨至完全溶解；进行细胞实验吋，用PBS溶解受试物，经0.22um滤膜滤过后备用。1.3实验动物体重为18g〜22g的NIH小白鼠，雌雄各半，共220只，由广东省医学实验动物中心（实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2008-0002）提供，合格证号:0109340。本所实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2009-0050。动物购进后先在实验动物房饲养2天，动物饲养室温度22°C-25°C

4、，相对湿度60%-70%,观察合格后进行正式实验。1.4细胞及其培养条件BALB/c3T3（小鼠胚成纤维细胞）购自中国科学院上海细胞库，细胞接种于25cm2的细胞培养瓶中，用含10%FBS的RPMI1640培养基在37°C、5%CO2的条件下进行常规培养。当细胞长至对数生长期吋，用0.25%胰酶进行传代或接种于96孔细胞培养板进行实验。1.5动物体内急性毒性实验试验前动物禁食12小时，不禁水。试验时按性别、体重将小鼠随机分组，雌雄各半。试验当天受试物组小鼠灌胃给予相应受试物，给药剂量见表1，对照组灌胃给予等体积纯化水,给药后观察小鼠毒性反应情况，连续观察14天。若动物未发生明显毒

5、性反应，则按最人耐受量法计算该受试物的最人耐受量；若动物发生死亡，则另取实验动物，进行LD50实验，根据实验结果计算药品的LD50值。1.63T3细胞中性红摄取实验取对数期生长的3T3细胞按1*105个/ml接种于96孔板，37°C,CO2培养箱中培养过夜使贴壁。用含5%FBS的RPMI1640培养基配制系列溶度受试物。最高浓度为200mg/ml,以1:2梯度往下稀释7个浓度，每个浓度3个平行孔，每孔加100uL受试物孵育24h，对照孔加lOOuL的培养基。染毒结束后，加150uL/孔预热PBS溶液冲洗2次，再加100ul中性红培养液（1ml25%中性红溶液+49ml含5%FBS

6、的培养基），孵育3h后，用PBS溶液冲洗2次，再加150ul/孔中性红解吸附液（含1%冰醋酸、49%三蒸水和50%无水乙醇），震荡lOmin（避光）后于酶标仪上读取540nm波长下的吸光度，实验重复2遍。1.73T3细胞MTT实验按1.6项方法接种、染毒，染毒结束前4h后，加20uL/孔MTT溶液。孵育4h后，移除上清液，加150ul/孔DMSO溶液，震荡lOmin（避光）后于酶标仪上读取490nm波长下的吸光度。实验重复2遍。1.8数据处理细胞死亡率计算公式：细胞死亡率（％）=（阴性对照吸光度-受试物吸光度）/阴性对照吸光度。GraphPadPrism软件计算LD50和IC50

7、值。1.结果2.1动物体内毒性实验结果实验结果详见表1,如表1所示，牵牛子、山豆根、雷公藤、制草乌、姜半夏、苦楝皮这6种中药配方颗粒按最大耐受量法进行急性毒性实验，均未测出LD50，当给药剂量相当于人临床用量的655-2211倍吋，实验小鼠均未出现异常。而附子（黑顺子）中药配方颗粒小鼠灌胃给药的半数致死量LD50为18013.4mg/kg,95%的可信限为16127.4mg/kg〜20281.5mg/kg;炮附片中药配方颗粒24小吋给药量≥26668mg/kg吋，小白鼠死亡