酶工程知识点

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1、酶的分离纯化需要考虑的几点：1、目标酶分子特性及其他物理、化学性质；2、酶分子和杂质的主要性质差异；3、酶的使用目的和要求；4、技术施舍的难易程度5、分离成本的高低；6、是否会造成环境污染。诱导作用：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用。无诱导物时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的结合较强。由于RNA聚合酶的结合位点与阻遏蛋白的结合位点相互重叠，当他们结合时，就把RNA聚合酶结合部位覆盖起来，在空间上排挤RNA聚合酶，使之脱离启动基因部位，使结构基因无法进行转录，酶的生物合成受阻。（不能转录）阻遏现象：酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶

2、的生物合成收到阻遏。在没有阻遏物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合，所以RNA聚合酶可以结合到其在启动基因的位点上，进行转录，而合成结构基因所对应的酶。（能够转录）当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增强。阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤RNA聚合酶与启动基因的结合，使转录无法进行，酶的生物合成因此受到阻遏。酶生物合成的模式：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型同步合成型（生长偶联型）：是酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。特点：在细胞进入生

3、长期时，酶大量合成、不受阻遏作用。延续合成型（部分生长偶联型）：是酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶还可以合成一段时间的一种酶生物合成模式。特点：在细胞进入平衡期还可以合成一段时间、受诱导物作用，不受阻遏物作用、mRNA相当稳定。中期合成型（生长偶联型）：在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而酶所对应的mRNA稳定性差。滞后合成型（非生长偶联型）：酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成大量积累。特点：受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用、

4、mRNA稳定性好。酶所对应的mRNA稳定性以及培养基中的阻遏作用是影响酶的生物合成的主要因素。在酶的发酵生产中，最理想的合成模式是延续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏，使其是生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止时间。微生物保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法。细胞活化：保藏的菌种在用

5、于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复。培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。扩大培养注意事项：1、氮源丰富2、培养到对数生长期，及时培养到发酵罐中3、减少传代次数，降低菌种衰退和污染的可能4、严格控制培养温度、pH、溶氧量。耗氧速率Ko2：指的是单位体积培养液中的细胞在单位时间内所消耗的氧气量。Qo2：是指单位细胞量在单位时间内的耗氧量。细胞呼吸强度Cc:指的是单位体积培养液中细胞的量。Ko2=Qo2·Cc溶氧速率Kd：是指单位体积的发酵液在单位时间内溶解氧的量。调节溶解氧的方法：1、调节通气量2、

6、调节氧的分压3、调节气液接触时间4、调节气液接触面积5、改变培养基的性质提高酶产量的措施：1、添加诱导物2、控制阻遏物的浓度3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂5、基因突变提高酶产量固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采取各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。固定化细胞发酵产酶的特点：1、提高产酶率2、可以反复使用或连续使用较长时间3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失4、发酵稳定性好5、缩短发酵周期，提高设备利用率6、产品容易分离纯化7、适用于胞外酶等胞外产物的生产固定化细胞发酵产酶的工艺条件及控制：1、固定化细胞的培养2、溶解氧的供给3

7、、温度的控制4、培养基的组分控制固定化原生质体的特点：1、变胞内产物为胞外产物2、提高酶产率3、稳定性好4、易于分离纯化固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制：1、渗透压的控制2、防止细胞壁再生3、保证原生质体的浓度端粒酶：是催化端粒合成和延长的酶，是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分。在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分作为模板把端粒重复序列加到染色体DNA的末端，使端粒延长。端粒延伸主要包括三个步骤：1、结合：端粒酶分子的RNA重复序列与D