【医学ppt课件】大鼠血管平滑肌细胞的培养

《【医学ppt课件】大鼠血管平滑肌细胞的培养》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、大鼠血管平滑肌细胞的培养金洪峰细胞培养方法组织块培养法消化培养法器官培养法将组织剪成小块后接种于培养瓶特点：简便易行、成功率较高。细胞培养方法组织块培养法消化培养法器官培养法结合生化和化学手段把已经剪切成较小体积的组织进行进一步分离，制成细胞悬液。主要有：胰蛋白酶法胶原酶法EDTA法细胞培养方法组织块培养法消化培养法器官培养法从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。体外培养细胞的分型贴附型:细胞贴附在支持物上生长悬浮型：不贴附于支持物，呈悬浮生长细胞培养实验室培养用品细胞培养液、培养基准备“无菌”细胞培养实验室无菌操作区（无菌操

2、作室、超净台）孵育区制备区储藏区清洗和消毒灭菌区培养试剂的配制Hank’s液(单位g)CaCl20.14KCl0.4KH2PO40.06MgSO4.7H2O0.10NaCl8.0NaHCO30.35Na2HPO4.12H2O0.12D-glucose1.0Phenolred0.01将CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中，其它成分溶在750mL的ddH2O中，混匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟，4℃冰箱保存。D-Hank’s液（单位：g）KCl0.40KH2PO40.06NaCl8.0NaHCO30.35Na2HPO4.12H2O0.08Phenolr

3、ed0.02将以上成分溶于900mLddH2O中，充分混匀，加ddH2O至1000mL。高压蒸气消毒10分钟，4℃冰箱保存。青霉素、链霉素液配制青霉素80万U加Hank’s液至80mL，终浓度1万u/mL链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s液至100mL，终浓度10mg/mL分装后至-20℃冰箱保存。DMEM培养液900mLddH2O于1000mL容器中，将DMEM粉1包倒入容器中，盛粉袋用50mLddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力搅拌溶解。加NaHCO3调PH至7.2加青、链霉素至终浓度100u/mL和100ug/mL0.22umX50滤膜过滤（负压泵抽吸），4℃冰箱保存。小牛、胎

4、牛血清灭活55℃水浴箱30分钟，置4℃冰箱保存灭活前放于-20℃冰箱保存待用临用前加入DMEM液中平滑肌细胞原代培养方法动物：大鼠150～180g，2～3只操作步骤大鼠颈椎脱臼致死固定消毒胸腹部大组织镊、组织剪切开胸腹部皮肤另一组织镊、组织剪切开胸腹部，并切除部分胸壁以利暴露眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hank’s液的细胞培养皿中，转入无菌室。或先用生理盐水漂洗，再放Hank’s液中，转入无菌室眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层。放入另一盛有Hank’s液的细胞培养皿中，剪去血管外的小分支放入含20%胎牛血清的DMEM中，眼科直剪剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细

5、胞放入另一含20%胎牛血清的DMEM中，用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm用吸管把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为0.5cm盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注入适量培养液，于37ºC孵箱内放置4～5小时，使得组织块干涸，并与瓶底贴附将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置3～5天，切勿移动。待有细胞从组织块周围游离出后换液平滑肌细胞传代传代时间：大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相接触时就可以传代传代步骤：倒掉培养瓶中的培养液用D-Hank’s液洗两遍加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞消化情况，可见到细胞质回缩，

6、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞脱离消化液注意：初次传代对胰酶敏感，加入消化液30s，即消化充分，以后2分钟左右细胞消化完成后，用吸管反复抽吸打散细胞中止消化：加入DMEM培养液3滴管，用吸管反复吹打瓶壁细胞离心：1500X5分钟倒掉液体，加D-Hank’s液洗一次，再加10mLDMEM培养液，用吸管抽吸吹打分散细胞，分装于2个培养瓶。在倒置纤微镜下可见圆形细胞。放入细胞培养箱中培养血管平滑肌细胞的冻存和复苏冻存时间：较早期传代，以防细胞因为传代次数过多而造成细胞衰老或发生改变，以保持实验条件的一致性。冻存方法：冻存前24小时更换培养液，冻存时要将密闭好的冻存管依次放于：4ºC2小时-20

7、ºC2.5小时液氮表面2小时浸入液氮培养细胞的鉴定1、形态学鉴定：用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律。并依据常规制作电镜标本进行观察电镜观察结果：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向排列，有密区，具备平滑肌细胞特征2、免疫组织化学鉴定：特异性鼠抗α－平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色免疫组织化学鉴定结果：镜下观察到细胞爬片，可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不